Impatto dei polimorfismi genici IL-28B rs12979860 e rs4803217 associati alla deregolazione dei miRNA sul carcinoma epatocellulare correlato all'HCV

introduzione

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la terza causa di morte per cancro in tutto il mondo. Nonostante i miglioramenti nella terapia dell'HCC, la prognosi per i pazienti con HCC rimane infausta a causa di un'elevata incidenza di recidiva. Una migliore comprensione della patogenesi dello sviluppo dell'HCC faciliterebbe lo sviluppo di esiti più efficaci per la diagnosi e il trattamento dell'HCC nelle fasi precedenti.

Attualmente, le alterazioni molecolari nei tumori vengono esaminate su scala genomica, coprendo diverse dimensioni, come l'espressione genica, i cambiamenti epigenetici, le aberrazioni cromosomiche e, più recentemente, il sequenziamento di nuova generazione. Un gran numero di marcatori molecolari è associato allo sviluppo di HCC. che potrebbe essere utile in clinica; tuttavia, sono state segnalate differenze razziali e queste devono essere esaminate in modo più approfondito.

Si stima che il 51,5% dei casi di HCC possa essere attribuito all'infezione da HCV. Tra questi, dobbiamo menzionare i polimorfismi del gene IL28B, ad es. rs12979860 C/T e rs4803217. Il gene IL-28B codifica per l'interferone-lamda 3 (IFN-λ3), che appartiene alla famiglia degli IFN di tipo III che include IFN-λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3. L'IFN-λ che interagisce con un recettore transmembrana induce potenti risposte antivirali mediate dall'attivazione delle vie JAK-STAT e MAPK. I polimorfismi di IL-28B sono legati all'efficienza del processo infiammatorio durante l'infezione da HCV e ai meccanismi che l'HCV adotta per sfuggire all'immunità innata e adattativa. È interessante notare che, poiché è stato scoperto che l'IFN di tipo III inibisce la replicazione sia dell'HBV che dell'HCV in modelli sperimentali, negli ultimi anni numerosi studi hanno valutato l'associazione tra i polimorfismi dell'IL-28B e il rischio di sviluppo di HCC e cirrosi epatica (LC) in diverse popolazioni; tuttavia, i risultati sono incoerenti e inconcludenti. Per questi motivi, è necessaria una profonda comprensione dell'impatto dei polimorfismi IL28B nell'insorgenza di HCC.

È interessante notare che alcuni polimorfismi situati nella regione 3' non tradotta (UTR) di IL28B, ad es. rs 4803217, sembrano interferire con il legame dei miRNA, ad oggi riconosciuti come importanti regolatori post-trascrizionali.

I miRNA, infatti, sono piccoli RNA interferenti, non codificanti, lunghi 21-30 nucleotidi, che possono promuovere la modulazione di oltre 200 mRNA e sono ampiamente associati ai tumori umani. Negli ultimi anni i miRNA hanno acquisito una crescente rilevanza come potenziali biomarcatori per diverse malattie tra cui il cancro.

In particolare, la scoperta di miRNA extracellulari, stabili in circolazione, spinge molti ricercatori nella loro valutazione mirata all'identificazione di nuovi marcatori diagnostici utili e meno invasivi anche per l'HCC.

Obiettivi

L'obiettivo generale è quello di studiare l'impatto dei polimorfismi dei geni IL-28B rs12979860 e rs4803217 associati alla deregolazione dei miRNA sul carcinoma epatocellulare correlato all'HCV

Obiettivi specifici:

1. Per determinare l'associazione dei polimorfismi IL 28B con il rischio di HCC nei pazienti con epatite C cronica.
2. Screening di un ampio pannello di miRNA per scoprire quelli deregolamentati durante la progressione dell'epatite C cronica verso l'HCC
3. Identificare un'associazione tra il(i) polimorfismo(i) di IL 28B e i principali miRNA deregolamentati come marcatore predittivo di HCC nei pazienti con epatite C cronica

Approccio e metodologia della ricerca

Pazienti e metodi:

Pazienti:

Questo studio includerà 405 soggetti divisi in 3 gruppi:

Gruppo 1. Questo gruppo includerà pazienti con epatite cronica C (n. =135) Gruppo2. Questo gruppo includerà pazienti con epatite cronica C (n. =135) con cirrosi (F4).

Gruppo3. Questo gruppo includerà pazienti con HCC correlato all'HCV (n. =135) Ciò è confermato dalla presenza di una lesione focale rilevata dall'imaging (tomografia computerizzata (TC) ed ecografia) e dall'elevata AFP sierica.

• La base del calcolo della dimensione del campione è la seguente:

• Proteina Alfa Feto: ses 41-60%, sp 80-94%
• Prevalenza di HCC tra i pazienti con infezione da HCV: 5-10%
• Il calcolo si basa sulla specificità della proteina alfa feto in media dell'87%

È richiesto un totale di 405 casi con una media di 135 casi/gruppo, basato su confidenza 90 e margine di errore 5%, prevalenza di HCC tra i pazienti con infezione da HCV 7%

Metodi:

1. I livelli sierici di α fetoproteina sono stati regolarmente testati in tutti i pazienti con cirrosi scompensata. I livelli di AFP erano generalmente elevati nei casi dimostrati essere HCC, tuttavia, i livelli variavano da 15 a 650 ng/ml. La diagnosi di HCC è stata confermata da una tomografia computerizzata multidetettore a 4 fasi (TC) o da una risonanza magnetica (MRI) con contrasto dinamico.
2. Quantificazione dell'RNA dell'HCV. Il plasma sarà ottenuto e l'RNA dell'HCV determinato mediante RT-PCR del plasma utilizzando il test Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. Polimorfismo IL28B:

   Gli SNP rs12979860 e 4803217 saranno determinati nel sangue intero mediante discriminazione allelica utilizzando sonde specifiche mediante real time PCR.

4. quantificazione del miRNA

   Gli RNA saranno estratti dal siero utilizzando il miRNeasy Mini Kit (Quiagen) secondo le istruzioni del produttore.

   La purezza dell'RNA sarà valutata dalla concentrazione dell'RNA e quantificata mediante NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, Stati Uniti).

   Il cDNA sarà ottenuto da miScript II Reverse Transcription Kits (Quiagen) Una preamplificazione sarà eseguita utilizzando miScript PreAMP PCR Kits (Quiagen) Real Time PCRarray sarà fatto usando miScript miRNA PCR Arrays, con SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Analisi statistica:

Le analisi statistiche saranno eseguite utilizzando il software SPSS Statistics. I valori P, 0,05 sono stati considerati significativi.

I confronti degli SNP di IL28B verranno effettuati stratificando i pazienti in base ai genotipi rs12979860CC e rs12979860CT/TT e l'analisi 4803217 miRNA PCR Array verrà eseguita mediante uno specifico software di analisi dei dati fornito specificamente da Quiagen.