Impacto dos polimorfismos do gene IL-28B rs12979860 e rs4803217 associados à desregulação de miRNAs no carcinoma hepatocelular relacionado ao HCV

Introdução

O carcinoma hepatocelular (CHC) é a terceira principal causa de mortes por câncer em todo o mundo. Apesar das melhorias na terapia do CHC, o prognóstico para os pacientes com CHC permanece ruim devido à alta incidência de recorrência. Uma melhor compreensão da patogênese do desenvolvimento do CHC facilitaria o desenvolvimento de resultados mais eficazes para o diagnóstico e tratamento do CHC em estágios iniciais.

Atualmente, as alterações moleculares nos tumores estão sendo examinadas em escala genômica ampla, abrangendo diferentes dimensões, como expressão gênica, alterações epigenéticas, aberrações cromossômicas e, mais recentemente, sequenciamento de próxima geração. Um grande número de marcadores moleculares está associado ao desenvolvimento do CHC. que pode ser útil na clínica; no entanto, diferenças raciais foram relatadas e precisam ser examinadas mais detalhadamente.

Estima-se que 51,5% dos casos de CHC podem ser atribuídos à infecção pelo HCV. Entre eles, temos que mencionar os polimorfismos do gene IL28B, por ex. rs12979860 C/T e rs4803217. O gene IL-28B codifica o interferon-lamda 3 (IFN-λ3), que pertence à família IFN tipo III, incluindo IFN-λ1, IFN-λ2 e IFN-λ3. A interação do IFN-λ com um receptor transmembrana induz respostas antivirais potentes mediadas pela ativação das vias JAK-STAT e MAPK. Os polimorfismos de IL-28B estão ligados à eficiência do processo inflamatório durante a infecção pelo HCV e aos mecanismos que o HCV adota para escapar pela imunidade inata e adaptativa. Curiosamente, uma vez que se descobriu que o IFN tipo III inibe a replicação do HBV e do HCV em modelos experimentais, nos últimos anos, vários estudos avaliaram a associação entre os polimorfismos de IL-28B e o risco de desenvolvimento de CHC e cirrose hepática (CL). em diferentes populações; no entanto, os resultados são inconsistentes e inconclusivos. Por essas razões, uma compreensão profunda do impacto dos polimorfismos de IL28B na ocorrência de CHC é obrigatória.

Curiosamente, alguns polimorfismos localizados na região não traduzida 3' (UTR) de IL28B, por ex. rs 4803217, parecem interferir na ligação de miRNAs, até hoje reconhecidos como importantes reguladores pós-transcricionais.

Os miRNAs, na verdade, são pequenos RNAs interferentes e não codificantes com 21 a 30 nucleotídeos de comprimento, que podem promover a modulação de mais de 200 mRNAs e estão amplamente associados a cânceres humanos. Nos últimos anos, os miRNAs adquiriram uma relevância crescente como potenciais biomarcadores para várias doenças, incluindo o câncer.

Em particular, a descoberta de miRNAs extracelulares, que são estáveis ​​em circulação, impulsiona muitos pesquisadores em sua avaliação visando a identificação de novos marcadores diagnósticos úteis e menos invasivos também para o CHC.

Objetivos

O objetivo geral é investigar o impacto dos polimorfismos dos genes IL-28B rs12979860 e rs4803217 associados à desregulação de miRNAs no carcinoma hepatocelular relacionado ao HCV

Objetivos específicos:

1. Determinar a associação do(s) polimorfismo(s) da IL 28B com o risco de CHC em pacientes com hepatite C crônica.
2. Rastrear um amplo painel de miRNAs para descobrir os desregulados durante a progressão da hepatite C crônica em direção ao CHC
3. Identificar uma associação entre o(s) polimorfismo(s) da IL 28B e os principais miRNAs desregulados como marcador preditor de CHC em pacientes com hepatite C crônica

Abordagem e Metodologia de Pesquisa

Pacientes e métodos:

Pacientes:

Este estudo incluirá 405 Sujeitos divididos em 3 grupos:

Grupo 1. Este grupo incluirá pacientes com hepatite C crônica (nº =135) Grupo2. Este grupo incluirá pacientes com hepatite C crônica (nº =135) com cirrose (F4).

Grupo3. Este grupo incluirá pacientes com CHC relacionado ao VHC (nº. =135) Isso é confirmado pela presença de lesão focal detectada por imagem (tomografia computadorizada (TC) e ultrassom) e AFP sérica elevada.

• A base do cálculo do tamanho da amostra é a seguinte:

• Proteína Alpha Feto: ses 41-60%, sp 80-94%
• Prevalência de HCC entre pacientes infectados por HCV: 5-10%
• O cálculo é baseado na especificidade da proteína alfa feto em média 87%

É necessário um total de 405 casos com média de 135 casos/grupo, com base na confiança 90 e margem de erro 5%, prevalência de HCC entre pacientes infectados pelo HCV 7%

Métodos:

1. Os níveis séricos de α-fetoproteína foram testados rotineiramente em todos os pacientes com cirrose descompensada. Os níveis de AFP geralmente estavam elevados nos casos comprovados de CHC, porém, os níveis variavam de 15 a 650 ng/ml. O diagnóstico de CHC foi confirmado por tomografia computadorizada (TC) multidetector de 4 fases ou ressonância magnética (RM) com contraste dinâmico.
2. Quantificação do ARN do VHC. O plasma será obtido e o RNA do VHC determinado por RT-PCR do plasma usando o teste Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. Polimorfismo IL28B:

   Os SNP rs12979860 e 4803217 serão determinados em sangue total por discriminação alélica usando sondas específicas por PCR em tempo real.

4. quantificação de miRNA

   Os RNAs serão extraídos do soro usando miRNeasy Mini Kit (Quiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

   A pureza do RNA será avaliada pela concentração de RNA e quantificada por NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, Estados Unidos).

   O cDNA será obtido por Kits de Transcrição Reversa miScript II (Quiagen) A pré-amplificação será realizada usando Kits miScript PreAMP PCR (Quiagen) O PCRarray em tempo real será feito usando miScript miRNA PCR Arrays, com SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Análise estatística:

As análises estatísticas serão realizadas usando o software SPSS Statistics. Valores de p, 0,05 foram considerados significativos.

As comparações dos SNPs IL28B serão feitas estratificando os pacientes de acordo com os genótipos rs12979860CC e rs12979860CT/TT e a análise 4803217 miRNA PCR Array será feita por um software específico de análise de dados fornecido especificamente pela Quiagen.