Impact van IL-28B rs12979860 en rs4803217 genpolymorfismen geassocieerd met miRNAs-deregulering op HCV-gerelateerd hepatocellulair carcinoom

Invoering

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is wereldwijd de derde belangrijkste doodsoorzaak door kanker. Ondanks verbeteringen in HCC-therapie blijft de prognose voor HCC-patiënten slecht vanwege een hoge incidentie van recidief. Een beter begrip van de pathogenese van HCC-ontwikkeling zou de ontwikkeling van effectievere resultaten voor de diagnose en behandeling van HCC in eerdere stadia vergemakkelijken.

Momenteel worden moleculaire veranderingen in tumoren op genoombrede schaal onderzocht, waarbij verschillende dimensies worden bestreken, zoals genexpressie, epigenetische veranderingen, chromosomale afwijkingen en meer recentelijk sequencing van de volgende generatie. Een groot aantal moleculaire markers wordt in verband gebracht met de ontwikkeling van HCC. dat zou handig kunnen zijn in de kliniek; er zijn echter raciale verschillen gemeld, en deze moeten grondiger worden onderzocht.

Geschat wordt dat 51,5% van de HCC-gevallen kan worden toegeschreven aan een HCV-infectie. Onder hen moeten we de polymorfismen van het IL28B-gen noemen, b.v. rs12979860 C/T en rs4803217. Het IL-28B-gen codeert voor interferon-lamda 3 (IFN-λ3), dat tot de type III IFN-familie behoort, waaronder IFN-λ1, IFN-λ2 en IFN-λ3. Interactie van IFN-λ met een transmembraanreceptor induceert krachtige antivirale reacties die worden gemedieerd door de activering van de JAK-STAT- en MAPK-routes. IL-28B-polymorfismen zijn gekoppeld aan de efficiëntie van het ontstekingsproces tijdens HCV-infectie en aan de mechanismen die HCV gebruikt om te ontsnappen door aangeboren en adaptieve immuniteit. Interessant is dat, aangezien type III IFN in experimentele modellen zowel HBV- als HCV-replicatie remt, de afgelopen jaren een aantal onderzoeken het verband hebben beoordeeld tussen de IL-28B-polymorfismen en het risico op HCC en de ontwikkeling van levercirrose (LC). in verschillende populaties; de resultaten zijn echter inconsistent en niet doorslaggevend. Om deze redenen is een goed begrip van de impact van IL28B-polymorfismen op het voorkomen van HCC verplicht.

Interessant is dat sommige polymorfismen gelokaliseerd in het 3' onvertaalde gebied (UTR) van IL28B, b.v. rs 4803217, lijken te interfereren met de binding van miRNA, tot op heden erkend als belangrijke post-transcriptionele regulatoren.

miRNA is in feite klein, interfererend, niet-coderend RNA met een lengte van 21-30 nucleotiden, dat de modulatie van meer dan 200 mRNA's kan bevorderen en wordt algemeen geassocieerd met menselijke kankers. In de afgelopen jaren heeft miRNA een groeiende relevantie verworven als potentiële biomarkers voor verschillende ziekten, waaronder kanker.

Met name de ontdekking van extracellulaire miRNA's, die stabiel in omloop zijn, drijft veel onderzoekers tot hun evaluatie gericht op de identificatie van nieuwe bruikbare en minder invasieve diagnostische markers, ook voor HCC.

Doelstellingen

Het algemene doel is om de impact van IL-28B rs12979860- en rs4803217-genpolymorfismen geassocieerd met deregulering van miRNA's op HCV-gerelateerd hepatocellulair carcinoom te onderzoeken.

Specifieke doelen:

1. Vaststellen van het verband tussen IL 28B-polymorfisme(n) en het risico op HCC bij chronische hepatitis C-patiënten.
2. Een breed panel van miRNA's screenen om de gedereguleerde miRNA's bloot te leggen tijdens chronische hepatitis C-progressie naar HCC
3. Identificatie van een verband tussen IL 28B-polymorfisme(n) en de belangrijkste gedereguleerde miRNA's als voorspellende marker van HCC bij chronische hepatitis C-patiënten

Onderzoeksaanpak en methodologie

Patienten en methodes:

Patiënten:

Deze studie zal 405 proefpersonen omvatten, verdeeld in 3 groepen:

Groep 1. Deze groep omvat patiënten met chronische hepatitis C (nr. =135) Groep2. Deze groep omvat patiënten met chronische hepatitis C (nr. =135) met cirrose (F4).

Groep3. Deze groep omvat patiënten met HCV-gerelateerde HCC (nr. =135) Dit wordt bevestigd door de aanwezigheid van een focale laesie gedetecteerd door middel van beeldvorming (computertomografie (CT) en echografie) en verhoogde serum-AFP.

• De basis van de berekening van de steekproefomvang is de volgende:

• Alpha Feto Protein: ses 41-60%, sp 80-94%
• Prevalentie van HCC onder HCV-geïnfecteerde patiënten: 5-10%
• Berekening is gebaseerd op specificiteit van alfa-foeto-eiwit van gemiddeld 87%

Een totaal van 405 gevallen met gemiddeld 135 gevallen/groep is vereist, gebaseerd op betrouwbaarheid 90 en foutmarge 5 %, prevalentie van HCC onder HCV-geïnfecteerde patiënten 7 %

methoden:

1. Serum α-foetoproteïnespiegels werden routinematig getest bij alle patiënten met gedecompenseerde cirrose. AFP-spiegels waren over het algemeen verhoogd in gevallen waarvan werd bewezen dat ze HCC waren, maar de niveaus varieerden van 15 tot 650 ng/ml. De diagnose van HCC werd bevestigd door een 4-fase multidetector computertomografie (CT) scan of dynamische contrastversterkte magnetische resonantie beeldvorming (MRI).
2. HCV RNA-kwantificering. Plasma zal worden verkregen en HCV-RNA zal worden bepaald door middel van RT-PCR van plasma met behulp van Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV-test (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. IL28B Polymorfisme:

   SNP rs12979860 en 4803217 zullen worden bepaald in volbloed door allelische discriminatie met behulp van specifieke sondes door middel van real-time PCR.

4. miRNA-kwantificering

   RNA's worden uit serum geëxtraheerd met behulp van miRNeasy Mini Kit (Quiagen) volgens de instructies van de fabrikant.

   De RNA-zuiverheid wordt beoordeeld aan de hand van de RNA-concentratie en gekwantificeerd door NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, Verenigde Staten).

   cDNA wordt verkregen door middel van miScript II Reverse Transcription Kits (Quiagen) Een preamplificatie wordt uitgevoerd met behulp van miScript PreAMP PCR-kits (Quiagen) Realtime PCRarray wordt uitgevoerd met behulp van miScript miRNA PCR-arrays, met SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Statistische analyse:

Statistische analyses worden uitgevoerd met behulp van SPSS Statistics software. P-waarden, 0,05 werden als significant beschouwd.

IL28B SNP's vergelijkingen zullen worden gedaan door patiënten te stratificeren volgens rs12979860CC en rs12979860CT/TT genotypen en 4803217 Analyse miRNA PCR Array zal worden gedaan door specifieke data-analysesoftware die specifiek door Quiagen wordt geleverd.