Indvirkning af IL-28B rs12979860 og rs4803217 genpolymorfismer forbundet med miRNAs deregulering på HCV-relateret hepatocellulært karcinom

Introduktion

Hepatocellulært karcinom (HCC) er den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald på verdensplan. På trods af forbedringer i HCC-terapi forbliver prognosen for HCC-patienter dårlig på grund af en høj forekomst af recidiv. En forbedret forståelse af patogenesen af ​​HCC-udvikling ville lette udviklingen af ​​mere effektive resultater for diagnosticering og behandling af HCC på tidligere stadier.

I øjeblikket bliver molekylære ændringer i tumorer undersøgt i en genomskala, der dækker forskellige dimensioner, såsom genekspression, epigenetiske ændringer, kromosomafvigelser og for nylig næste generations sekventering. Et stort antal molekylære markører er forbundet med udviklingen af ​​HCC. det kunne være nyttigt i klinikken; raceforskelle er dog blevet rapporteret, og disse skal undersøges mere grundigt.

Det anslås, at 51,5 % af HCC-tilfældene kan tilskrives HCV-infektion. Blandt dem skal vi nævne polymorfismerne af IL28B-genet, f.eks. rs12979860 C/T og rs4803217. IL-28B-genet koder for interferon-lamda 3 (IFN-λ3), som tilhører type III IFN-familien, herunder IFN-λ1, IFN-λ2 og IFN-λ3. IFN-λ, der interagerer med en transmembranreceptor, inducerer potente antivirale responser medieret af aktiveringen af ​​JAK-STAT- og MAPK-vejene. IL-28B polymorfismer er forbundet med effektiviteten af ​​den inflammatoriske proces under HCV-infektion og til de mekanismer, som HCV anvender for at undslippe ved medfødt og adaptiv immunitet. Interessant nok, da type III IFN har vist sig at hæmme både HBV- og HCV-replikation i eksperimentelle modeller, har en række undersøgelser i løbet af de sidste år vurderet sammenhængen mellem IL-28B polymorfismer og risiko for HCC og levercirrhose (LC) udvikling i forskellige populationer; resultaterne er imidlertid inkonsekvente og inkonsekvente. Af disse grunde er en dyb forståelse af virkningen af ​​IL28B polymorfismer i HCC-forekomst obligatorisk.

Interessant nok er nogle polymorfier lokaliseret ved den 3' utranslaterede region (UTR) af IL28B, f.eks. rs 4803217, synes at interferere med bindingen af ​​miRNA, der hidtil er anerkendt som vigtige post-transkriptionelle regulatorer.

miRNA er faktisk lille, interfererende, ikke-kodende RNA, der er 21-30 nukleotider i længden, som kan fremme moduleringen af ​​mere end 200 mRNA'er og er bredt forbundet med humane kræftformer. I de seneste år har miRNA opnået en voksende relevans som potentielle biomarkører for flere sygdomme, herunder kræft.

Især opdagelsen af ​​ekstracellulært miRNA, som er stabilt i cirkulation, driver mange forskere i deres evaluering med henblik på at identificere nye nyttige og mindre invasive diagnostiske markører også for HCC.

Mål

Det overordnede mål er at undersøge virkningen af ​​IL-28B rs12979860 og rs4803217 genpolymorfismer forbundet med miRNAs deregulering på HCV-relateret hepatocellulært karcinom

Specifikke mål:

1. At bestemme sammenhængen mellem IL 28B polymorfi(er) med risikoen for HCC hos patienter med kronisk hepatitis C.
2. At screene et bredt panel af miRNA'er for at afdække de deregulerede under kronisk hepatitis C progression mod HCC
3. At identificere en sammenhæng mellem IL 28B polymorfi(er) og de vigtigste deregulerede miRNA'er som prædiktormarkør for HCC hos kroniske hepatitis C-patienter

Forskningstilgang og metode

Patienter og metoder:

Patienter:

Denne undersøgelse vil omfatte 405 emner opdelt i 3 grupper:

Gruppe 1. Denne gruppe vil omfatte patienter med kronisk hepatitis C (nr. =135) Gruppe2. Denne gruppe vil omfatte patienter med kronisk hepatitis C (nr. =135) med cirrhose (F4).

Gruppe 3. Denne gruppe vil omfatte patienter med HCV-relateret HCC (nr. =135) Dette bekræftes af tilstedeværelsen af ​​fokal læsion detekteret ved billeddannelse (computertomografi (CT) og ultralyd) og forhøjet serum-AFP.

• Grundlaget for beregningen af ​​stikprøvestørrelsen er følgende:

• Alpha Feto Protein: ses 41-60%, sp 80-94%
• Forekomst af HCC blandt HCV-inficerede patienter: 5-10 %
• Beregningen er baseret på specificitet af alfa-føtoprotein på gennemsnitlig 87 %

I alt 405 tilfælde med gennemsnitligt 135 tilfælde/gruppe er påkrævet, baseret på konfidens 90 og fejlmargin 5 %, prævalens af HCC blandt HCV-inficerede patienter 7 %

Metoder:

1. Serum α-fetoproteinniveauer blev rutinemæssigt testet hos alle patienter med dekompenseret cirrhose. AFP-niveauer var generelt forhøjede i tilfælde, der viste sig at være HCC, men niveauerne varierede fra 15 til 650 ng/ml. Diagnosen HCC blev bekræftet ved en 4-fase multidetektor computertomografi (CT) scanning eller dynamisk kontrastforstærket magnetisk resonansbilleddannelse (MRI).
2. HCV RNA kvantificering. Plasma vil blive opnået og HCV RNA bestemt ved RT-PCR af plasma ved hjælp af Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. IL28B polymorfi:

   SNP rs12979860 og 4803217 vil blive bestemt i fuldblod ved allelisk skelnen ved brug af specifikke prober ved realtids-PCR.

4. miRNA kvantificering

   RNA'er vil blive ekstraheret fra serum ved hjælp af miRNeasy Mini Kit (Quiagen) i henhold til producentens instruktioner.

   RNA-renheden vil blive vurderet ved RNA-koncentrationen og kvantificeret ved NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, USA).

   cDNA vil blive opnået med miScript II Reverse Transcription Kits (Quiagen) En præamplifikation vil blive udført ved hjælp af miScript PreAMP PCR Kits (Quiagen) Real Time PCRarray vil blive udført ved hjælp af miScript miRNA PCR Arrays, med SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Statistisk analyse:

Statistiske analyser vil blive udført ved hjælp af SPSS Statistics software. P-værdier, 0,05, blev betragtet som signifikante.

IL28B SNPs sammenligninger vil blive udført ved at stratificere patienter i henhold til rs12979860CC og rs12979860CT/TT genotyper og 4803217 Analyse miRNA PCR Array vil blive udført af specifik dataanalysesoftware, der er specifikt leveret af Quiagen.