Auswirkungen der IL-28B-Genpolymorphismen rs12979860 und rs4803217 im Zusammenhang mit miRNAs-Deregulierung auf HCV-assoziiertes hepatozelluläres Karzinom

Einführung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist weltweit die dritthäufigste Todesursache durch Krebs. Trotz Verbesserungen in der HCC-Therapie bleibt die Prognose für HCC-Patienten aufgrund einer hohen Rezidivinzidenz schlecht. Ein verbessertes Verständnis der Pathogenese der HCC-Entwicklung würde die Entwicklung effektiverer Ergebnisse für die Diagnose und Behandlung von HCC in früheren Stadien erleichtern.

Derzeit werden molekulare Veränderungen in Tumoren auf genomweiter Ebene untersucht, die verschiedene Dimensionen wie Genexpression, epigenetische Veränderungen, Chromosomenaberrationen und in jüngerer Zeit die Sequenzierung der nächsten Generation abdecken. Eine Vielzahl molekularer Marker sind mit der Entstehung des HCC assoziiert. das könnte in der Klinik nützlich sein; Es wurden jedoch Rassenunterschiede gemeldet, die gründlicher untersucht werden müssen.

Es wird geschätzt, dass 51,5 % der HCC-Fälle einer HCV-Infektion zugeschrieben werden können. Unter ihnen müssen wir die Polymorphismen des IL28B-Gens erwähnen, z. rs12979860 C/T und rs4803217. Das IL-28B-Gen kodiert für Interferon-lamda 3 (IFN-λ3), das zur Typ-III-IFN-Familie gehört, einschließlich IFN-λ1, IFN-λ2 und IFN-λ3. IFN-λ, das mit einem Transmembranrezeptor interagiert, induziert starke antivirale Reaktionen, die durch die Aktivierung der JAK-STAT- und MAPK-Signalwege vermittelt werden. IL-28B-Polymorphismen sind mit der Effizienz des Entzündungsprozesses während einer HCV-Infektion und mit den Mechanismen verbunden, die HCV anwendet, um der angeborenen und adaptiven Immunität zu entgehen. Da festgestellt wurde, dass Typ-III-IFN in experimentellen Modellen sowohl die HBV- als auch die HCV-Replikation hemmt, wurde interessanterweise in den letzten Jahren eine Reihe von Studien den Zusammenhang zwischen den IL-28B-Polymorphismen und dem Risiko der Entwicklung von HCC und Leberzirrhose (LC) untersucht in verschiedenen Populationen; Die Ergebnisse sind jedoch inkonsistent und nicht schlüssig. Aus diesen Gründen ist ein tiefes Verständnis der Auswirkungen von IL28B-Polymorphismen auf das Auftreten von HCC zwingend erforderlich.

Interessanterweise sind einige Polymorphismen, die sich in der 3'-untranslatierten Region (UTR) von IL28B befinden, z. rs 4803217, scheinen die Bindung von miRNA zu stören, die bis heute als wichtige posttranskriptionelle Regulatoren anerkannt sind.

Tatsächlich handelt es sich bei miRNA um kleine, interferierende, nicht codierende RNA mit einer Länge von 21–30 Nukleotiden, die die Modulation von mehr als 200 mRNAs fördern kann und weithin mit menschlichen Krebsarten in Verbindung gebracht wird. In den letzten Jahren hat miRNA eine wachsende Bedeutung als potenzieller Biomarker für verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs, erlangt.

Insbesondere die Entdeckung von extrazellulärer miRNA, die im Umlauf stabil ist, treibt viele Forscher zu ihrer Evaluierung an, die auf die Identifizierung neuer nützlicher und weniger invasiver diagnostischer Marker auch für HCC abzielt.

Ziele

Das übergeordnete Ziel ist die Untersuchung der Auswirkungen der IL-28B-Genpolymorphismen rs12979860 und rs4803217, die mit der Deregulierung von miRNAs auf HCV-assoziiertes hepatozelluläres Karzinom assoziiert sind

Bestimmte Ziele:

1. Bestimmung der Assoziation von IL 28B-Polymorphismus(en) mit dem HCC-Risiko bei Patienten mit chronischer Hepatitis C.
2. Screening einer breiten Palette von miRNAs, um die deregulierten während der chronischen Hepatitis-C-Progression in Richtung HCC aufzudecken
3. Identifizierung einer Assoziation zwischen IL-28B-Polymorphismus(en) und den wichtigsten deregulierten miRNAs als Prädiktormarker für HCC bei Patienten mit chronischer Hepatitis C

Forschungsansatz und Methodik

Patienten und Methoden:

Patienten:

Diese Studie umfasst 405 Probanden, die in 3 Gruppen unterteilt sind:

Gruppe 1. Diese Gruppe umfasst Patienten mit chronischer Hepatitis C (Nr. = 135) Gruppe 2. Diese Gruppe umfasst Patienten mit chronischer Hepatitis C (Nr. = 135) mit Zirrhose (F4).

Gruppe3. Diese Gruppe umfasst Patienten mit HCV-bedingtem HCC (Nr. =135) Dies wird durch das Vorhandensein einer fokalen Läsion bestätigt, die durch Bildgebung (Computertomographie (CT) und Ultraschall) und erhöhtes AFP im Serum festgestellt wurde.

• Die Grundlage der Berechnung des Stichprobenumfangs ist folgende:

• Alpha-Feto-Protein: se 41–60 %, sp 80–94 %
• Prävalenz von HCC bei HCV-infizierten Patienten: 5-10 %
• Die Berechnung basiert auf der Spezifität des Alpha-Feto-Proteins von durchschnittlich 87 %

Insgesamt 405 Fälle mit durchschnittlich 135 Fällen/Gruppe sind erforderlich, basierend auf Konfidenz 90 und Fehlerquote 5 %, HCC-Prävalenz bei HCV-infizierten Patienten 7 %

Methoden:

1. Serum-α-Fetoproteinspiegel wurden routinemäßig bei allen Patienten mit dekompensierter Zirrhose getestet. Die AFP-Spiegel waren im Allgemeinen in Fällen erhöht, die sich als HCC erwiesen hatten, die Werte lagen jedoch zwischen 15 und 650 ng/ml. Die Diagnose eines HCC wurde durch eine 4-Phasen-Multidetektor-Computertomographie (CT) oder eine dynamische kontrastverstärkte Magnetresonanztomographie (MRT) bestätigt.
2. HCV-RNA-Quantifizierung. Es wird Plasma gewonnen und die HCV-RNA durch RT-PCR des Plasmas unter Verwendung des Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV-Tests (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ)) bestimmt.

3. IL28B Polymorphismus:

   SNP rs12979860 und 4803217 werden in Vollblut durch allelische Diskriminierung unter Verwendung spezifischer Sonden durch Echtzeit-PCR bestimmt.

4. miRNA-Quantifizierung

   RNAs werden aus dem Serum mit dem miRNeasy Mini Kit (Quiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.

   Die RNA-Reinheit wird anhand der RNA-Konzentration bewertet und mit NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, USA) quantifiziert.

   cDNA wird mit miScript II Reverse Transcription Kits (Quiagen) erhalten. Eine Voramplifikation wird mit miScript PreAMP PCR Kits (Quiagen) durchgeführt. Real Time PCRarray wird mit miScript miRNA PCR Arrays mit SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen) durchgeführt.

5. Statistische Analyse:

Statistische Analysen werden mit der Software SPSS Statistics durchgeführt. P-Werte von 0,05 wurden als signifikant angesehen.

IL28B-SNPs-Vergleiche werden durchgeführt, indem Patienten gemäß rs12979860CC- und rs12979860CT/TT-Genotypen stratifiziert werden, und die 4803217-Analyse miRNA-PCR-Array wird mit einer speziellen Datenanalyse-Software durchgeführt, die speziell von Quiagen bereitgestellt wird.