Effekten av IL-28B rs12979860 och rs4803217 genpolymorfismer associerade med miRNA-avreglering på HCV-relaterat hepatocellulärt karcinom

Introduktion

Hepatocellulärt karcinom (HCC) är den tredje vanligaste orsaken till dödsfall i cancer i världen. Trots förbättringar i HCC-terapi är prognosen för HCC-patienter fortfarande dålig på grund av en hög incidens av återfall. En förbättrad förståelse av patogenesen av HCC-utveckling skulle underlätta utvecklingen av mer effektiva resultat för diagnos och behandling av HCC i tidigare skeden.

För närvarande granskas molekylära förändringar i tumörer i en genomomfattande skala, som täcker olika dimensioner, såsom genuttryck, epigenetiska förändringar, kromosomavvikelser och på senare tid, nästa generations sekvensering. Ett stort antal molekylära markörer är associerade med utvecklingen av HCC. som kan vara användbart på kliniken; rasskillnader har dock rapporterats, och dessa måste undersökas mer ingående.

Det uppskattas att 51,5 % av HCC-fallen kan hänföras till HCV-infektion. Bland dem måste vi nämna polymorfismerna av IL28B-genen, t.ex. rs12979860 C/T och rs4803217. IL-28B-genen kodar för interferon-lamda 3 (IFN-λ3), som tillhör typ III IFN-familjen inklusive IFN-λ1, IFN-λ2 och IFN-λ3. IFN-λ som interagerar med en transmembranreceptor inducerar potenta antivirala svar medierade av aktiveringen av JAK-STAT- och MAPK-vägarna. IL-28B-polymorfismer är kopplade till effektiviteten av den inflammatoriska processen under HCV-infektion och till de mekanismer som HCV använder för att fly genom medfödd och adaptiv immunitet. Intressant nog, eftersom typ III IFN har visat sig hämma både HBV- och HCV-replikation i experimentella modeller, har under de senaste åren ett antal studier utvärderat sambandet mellan IL-28B polymorfismer och risken för HCC och levercirros (LC) utveckling i olika populationer; men resultaten är inkonsekventa och ofullständiga. Av dessa skäl är en djup förståelse av effekten av IL28B-polymorfismer vid HCC-förekomst obligatorisk.

Intressant är att vissa polymorfismer lokaliserade vid den 3' otranslaterade regionen (UTR) av IL28B, t.ex. rs 4803217, verkar störa bindningen av miRNA, som hittills erkänts som viktiga post-transkriptionella regulatorer.

miRNA är i själva verket små, störande, icke-kodande RNA som är 21-30 nukleotider långa, som kan främja moduleringen av mer än 200 mRNA och är allmänt associerade med humana cancerformer. Under de senaste åren har miRNA fått en växande relevans som potentiella biomarkörer för flera sjukdomar inklusive cancer.

I synnerhet upptäckten av extracellulärt miRNA, som är stabilt i cirkulationen, driver många forskare på sin utvärdering som syftar till att identifiera nya användbara och mindre invasiva diagnostiska markörer även för HCC.

Mål

Det övergripande målet är att undersöka effekten av IL-28B rs12979860 och rs4803217 genpolymorfismer associerade med miRNAs avreglering på HCV-relaterat hepatocellulärt karcinom

Specifika mål:

1. Att fastställa sambandet mellan IL 28B-polymorfi(er) med risken för HCC hos patienter med kronisk hepatit C.
2. Att screena en bred panel av miRNA för att avslöja de avreglerade under kronisk hepatit C-progression mot HCC
3. För att identifiera ett samband mellan IL 28B polymorfism(er) och de viktigaste avreglerade miRNA:erna som prediktormarkör för HCC hos patienter med kronisk hepatit C

Forskningsmetod och metodik

Patienter och metoder:

Patienter:

Denna studie kommer att omfatta 405 ämnen indelade i 3 grupper:

Grupp 1. Denna grupp kommer att inkludera patienter med kronisk hepatit C (nr =135) Grupp2. Denna grupp kommer att inkludera patienter med kronisk hepatit C (nr =135) med cirros (F4).

Grupp 3. Denna grupp kommer att inkludera patienter med HCV-relaterat HCC (nr. =135) Detta bekräftas av närvaron av fokal lesion detekterad med bildbehandling (datortomografi (CT) och ultraljud), och förhöjd serum-AFP.

• Grunden för beräkningen av urvalsstorleken är följande:

• Alpha Feto Protein: ses 41-60%, sp 80-94%
• Prevalens av HCC bland HCV-infekterade patienter: 5-10 %
• Beräkningen är baserad på specificiteten för alfa-fetoprotein på i genomsnitt 87 %

Totalt 405 fall med i genomsnitt 135 fall/grupp krävs, baserat på konfidens 90 och felmarginal 5 %, prevalens av HCC bland HCV-infekterade patienter 7 %

Metoder:

1. Serum α-fetoproteinnivåer testades rutinmässigt hos alla patienter med dekompenserad cirros. AFP-nivåerna var generellt förhöjda i fall som visade sig vara HCC, men nivåerna varierade från 15 till 650 ng/ml. Diagnosen HCC bekräftades av en 4-fas multidetektor datortomografi (CT) scan eller dynamisk kontrastförstärkt magnetisk resonanstomografi (MRT).
2. HCV RNA kvantifiering. Plasma kommer att erhållas och HCV-RNA bestämmas genom RT-PCR av plasma med hjälp av Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV-test (Roche Diagnostics, Branchburg, (NJ).

3. IL28B polymorfism:

   SNP rs12979860 och 4803217 kommer att bestämmas i helblod genom allelisk diskriminering med användning av specifika prober genom realtids-PCR.

4. miRNA kvantifiering

   RNA kommer att extraheras från serum med hjälp av miRNeasy Mini Kit (Quiagen) enligt tillverkarens instruktioner.

   RNA-renheten kommer att bedömas av RNA-koncentrationen och kvantifieras med NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, USA).

   cDNA kommer att erhållas av miScript II Reverse Transcription Kits (Quiagen) En föramplifiering kommer att utföras med miScript PreAMP PCR Kits (Quiagen) Realtids PCRarray kommer att göras med miScript miRNA PCR Arrays, med SYBR Green PCR Master Mix (Quiagen).

5. Statistisk analys:

Statistiska analyser kommer att utföras med SPSS Statistics programvara. P-värden, 0,05 ansågs signifikanta.

Jämförelser av IL28B SNP:s kommer att göras genom att stratifiera patienter enligt rs12979860CC och rs12979860CT/TT genotyper och 4803217 Analys miRNA PCR Array kommer att göras av specifik dataanalysmjukvara som specifikt tillhandahålls av Quiagen.