Влияние полиморфизмов генов IL-28B rs12979860 и rs4803217, связанных с нарушением регуляции микроРНК, на гепатоцеллюлярную карциному, связанную с ВГС

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является третьей ведущей причиной смерти от рака во всем мире. Несмотря на улучшение терапии ГЦК, прогноз для пациентов с ГЦК остается неблагоприятным из-за высокой частоты рецидивов. Улучшение понимания патогенеза развития ГЦК будет способствовать разработке более эффективных результатов диагностики и лечения ГЦК на более ранних стадиях.

В настоящее время молекулярные изменения в опухолях тщательно изучаются в масштабе всего генома, охватывая различные измерения, такие как экспрессия генов, эпигенетические изменения, хромосомные аберрации и, в последнее время, секвенирование следующего поколения. Большое количество молекулярных маркеров связано с развитием ГЦК. что может пригодиться в клинике; однако сообщалось о расовых различиях, и их необходимо изучить более тщательно.

Подсчитано, что 51,5% случаев ГЦК могут быть связаны с инфекцией ВГС. Среди них следует отметить полиморфизмы гена IL28B, т.е. RS12979860 C/T и RS4803217. Ген IL-28B кодирует интерферон-лямда 3 (IFN-λ3), который принадлежит к семейству IFN типа III, включая IFN-λ1, IFN-λ2 и IFN-λ3. IFN-λ, взаимодействуя с трансмембранным рецептором, индуцирует мощные противовирусные ответы, опосредованные активацией путей JAK-STAT и MAPK. Полиморфизмы IL-28B связаны с эффективностью воспалительного процесса во время инфекции HCV и с механизмами, которые HCV применяет, чтобы избежать врожденного и адаптивного иммунитета. Интересно, что, поскольку было обнаружено, что интерферон III типа ингибирует репликацию как HBV, так и HCV в экспериментальных моделях. В последние годы в ряде исследований оценивалась связь между полиморфизмом IL-28B и риском развития ГЦК и цирроза печени (ЦП). в разных популяциях; однако результаты противоречивы и неубедительны. По этим причинам глубокое понимание влияния полиморфизмов IL28B на возникновение ГЦР является обязательным.

Интересно, что некоторые полиморфизмы, расположенные в 3'-нетранслируемой области (UTR) IL28B, напр. rs 4803217, по-видимому, препятствуют связыванию микроРНК, которые на сегодняшний день признаны важными посттранскрипционными регуляторами.

миРНК, по сути, представляют собой небольшие интерферирующие некодирующие РНК длиной 21-30 нуклеотидов, которые могут способствовать модуляции более 200 мРНК и широко связаны с раком человека. В последние годы микроРНК приобрели все большее значение в качестве потенциальных биомаркеров ряда заболеваний, включая рак.

В частности, открытие внеклеточных микроРНК, которые стабильны в циркуляции, побуждает многих исследователей к их оценке, направленной на выявление новых полезных и менее инвазивных диагностических маркеров также для ГЦК.

Цели

Общая цель состоит в том, чтобы исследовать влияние полиморфизмов генов IL-28B rs12979860 и rs4803217, связанных с нарушением регуляции миРНК, на гепатоцеллюлярную карциному, связанную с ВГС.

Конкретные цели:

1. Определить связь полиморфизма(ов) IL 28B с риском развития ГЦК у пациентов с хроническим гепатитом С.
2. Провести скрининг широкой панели миРНК для выявления дерегуляции во время прогрессирования хронического гепатита С до ГЦК.
3. Выявить связь между полиморфизмом(ами) IL 28B и основными нерегулируемыми миРНК в качестве маркера-предиктора ГЦК у пациентов с хроническим гепатитом С.

Исследовательский подход и методология

Пациенты и методы:

Пациенты:

Это исследование будет включать 405 субъектов, разделенных на 3 группы:

Группа 1. В эту группу войдут больные хроническим гепатитом С (№=135) Группа 2. В эту группу войдут больные хроническим гепатитом С (№=135) с циррозом печени (F4).

Группа3. В эту группу будут входить пациенты с ГЦК, связанным с ВГС (№. =135) Это подтверждается наличием очагового поражения, обнаруженного при визуализации (компьютерная томография (КТ) и УЗИ), и повышенным уровнем АФП в сыворотке.

• Основанием для расчета размера выборки является следующее:

• Альфа-фетопротеин: ses 41-60%, sp 80-94%
• Распространенность ГЦК среди пациентов, инфицированных ВГС: 5-10%.
• Расчет основан на специфичности белка альфа-фето в среднем 87%.

Всего требуется 405 случаев, в среднем 135 случаев на группу, при доверительной вероятности 90 и погрешности 5 %, распространенность ГЦК среди пациентов, инфицированных ВГС, 7 %.

Методы:

1. Уровни α-фетопротеина в сыворотке рутинно определяли у всех пациентов с декомпенсированным циррозом печени. Уровни АФП обычно были повышены в случаях, когда было доказано, что это ГЦК, однако уровни варьировались от 15 до 650 нг/мл. Диагноз ГЦР был подтвержден с помощью 4-фазной мультидетекторной компьютерной томографии (КТ) или магнитно-резонансной томографии (МРТ) с динамическим контрастом.
2. Количественное определение РНК ВГС. Будет получена плазма, и РНК ВГС будет определена с помощью ОТ-ПЦР плазмы с использованием теста Cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV (Roche Diagnostics, Бранчбург, (Нью-Джерси).

3. IL28B Полиморфизм:

   SNP rs12979860 и 4803217 будут определяться в цельной крови путем аллельной дискриминации с использованием специфических зондов методом ПЦР в реальном времени.

4. количественная оценка микроРНК

   РНК будут экстрагировать из сыворотки с помощью набора miRNeasy Mini Kit (Quiagen) в соответствии с инструкцией производителя.

   Чистоту РНК будут оценивать по концентрации РНК и количественно определять с помощью NanoDrop ND-1000 (Nanodrop, США).

   кДНК получают с помощью наборов для обратной транскрипции miScript II (Quiagen). Предварительную амплификацию проводят с использованием наборов для ПЦР miScript PreAMP (Quiagen). ПЦР-массив в реальном времени проводят с использованием массивов для ПЦР miScript miRNA с мастер-миксом SYBR Green PCR (Quiagen).

5. Статистический анализ:

Статистический анализ будет проводиться с использованием программного обеспечения SPSS Statistics. Значения P, 0,05, считались значимыми.

Сравнения SNP IL28B будут выполняться путем стратификации пациентов в соответствии с генотипами rs12979860CC и rs12979860CT/TT, а анализ ПЦР-массива микроРНК 4803217 будет выполняться с помощью специального программного обеспечения для анализа данных, специально предоставленного Quiagen.