Golimumabin vaikutus suoliston mikrobiston modulaatioon haavaisessa paksusuolentulehduksessa (GOLI2015)

Golimumabivaikutus suoliston mikrobiotan modulaatiossa haavaisessa paksusuolentulehduksessa. Esitutkimus.

1. TAUSTA Äskettäin johdonmukainen joukko todisteita osoittaa, että suoliston mikrobiotan kykyä moduloida ja ohjata isännän immuunivastetta pidetään yhtenä keskeisistä tekijöistä, jotka muokkaavat herkkää tasapainoa terveyden ja sairauden välillä ruoansulatuskanavan sairauksissa. Tulehduksellisessa suolistosairaudessa (IBD) suoliston mikrobiotalla on keskeinen rooli potilaan mikrobiologisen homeostaasin ylläpitämisessä. Viimeaikaiset tutkimukset kuvaavat IBD-potilaiden ja terveiden yksilöiden suoliston mikrobiston eri malleja. Mikrobiologisen mallin muutosta, joka ei liity sairauteen, kutsutaan dysbioosiksi ja se liittyy suoraan suoliston limakalvon tulehduksen asteeseen ja siten kliinisen tilan tilaan: suurempi dysbioosi, suurempi kliininen korrelaatio sairauden tilaan, niin että suoliston mikrobiota on paksusuolen tulehduksen tilan suora merkki.

Dysbioosin tilaa mitataan paksusuolen bakteeripopulaation erilaisilla mikrobiologisilla indekseillä. Muutokset näiden indeksien määrissä ovat parametreja, jotka mitataan luonnehtimaan potilaiden suoliston mikrobiota. Haavaisen paksusuolitulehduksen (UC) tapauksessa tutkimukset ovat osoittaneet, että suoliston mikrobiota on keskeinen tekijä syvän remission ja taudin pahenemisen välisen tasapainon ylläpitämisessä. Edistymisestä huolimatta syvällinen tieto siitä, kuinka suoliston mikrobiota on vuorovaikutuksessa suolen limakalvon kanssa ja muuttaa suolen estettä ja molekyyli-/geneettistä mekanismia, on edelleen tuntematon. Jotkut geenit ja niihin liittyvät kofaktorit on tunnistettu, mutta tarkkaa vuorovaikutusmekanismia ei ole vielä kuvattu. Tiedot osoittavat, että oletettavasti säätelymekanismi on monitekijäinen prosessi.

Tällä tavoin syvä ymmärrys suolen mikrobiotosta ja sen vuorovaikutuksista isännän ja paksusuolen kanssa on erittäin kiinnostavaa, jotta voidaan muokata IBD-hoidon, erityisesti UC:n, tulevaisuutta. Siten IBD-potilaiden suoliston mikrobiota voisi olla joko itse terapeuttinen kohde (ulosteensiirto) tai sitä voidaan pitää säädettävänä adjuvanttina immunomodulaattoreilla. Anti-TNF-lääkkeiden ryhmä on viimeksi sisällytetty UC:n terapeuttiseen arsenaaliin, joissakin tapauksissa muuttuen. taudin luonnollinen kirous. Vielä ei kuitenkaan tiedetä, kuinka nämä lääkkeet moduloivat suoliston mikrobiota ja miten ne häiritsevät sitä, vaikka niillä todennäköisesti on rooli. Viimeaikaiset tutkimustulokset ryhmämme tutkimuksista osoittavat, että kliinisen remission saavuttaessa suoliston mikrobiota muuttuu malleiksi, jotka eivät liity vähemmän dysbioosiin. Ottaen huomioon anti-TNF-lääkkeiden käytön kasvavan merkityksen, on erittäin mielenkiintoista tehdä ero dysbioosiin liittyvien ja terveeseen limakalvoon liittyvien kuvioiden välillä ja kuinka ne muuttuvat anti-TNF-lääkkeiden käytön seurauksena. Tällä tavoin ryhmämme aikaisemmat tulokset, jotka analysoivat Adalimumab anti-TNF -lääkehoitoon liittyviä suoliston mikrobiotan muutoksia, ovat osoittaneet, että potilaan etenemisen aikana remissioon limakalvon dysbioosikuvio muuttuu. Toisaalta ryhmämme on myös havainnut, että lääkehoidon epäonnistumisen jälkeen suoliston mikrobiota palaa lähemmäksi dysbioosia. Tästä syystä suoliston mikrobiotaa voitaisiin pitää erinomaisena indikaattorina lääkkeen todellisesta tehokkuudesta potilaassa.

Golimumabin, äskettäin käyttöön otetun anti-TNF-lääkehoidon osalta UC:ssa, ei vielä tiedetä, kuinka se pystyy muuntamaan suoliston mikrobiotan remissioihin liittyviin malleihin, koska toistaiseksi ei ole saatavilla tutkimuksia golimumabin ja tämän ilmiön välisestä suhteesta.

Prebioottien ja probioottien käyttö on osoittanut jonkin verran tehoa adjuvantteina UC:n hoidossa. Tästä syystä suoliston mikrobiotakuvioiden lisäkarakterisointi on erittäin tärkeää uusien strategioiden kehittämiseksi adjuvantin kyvylle moduloida sitä, erityisesti potilailla, jotka saavat anti-TNF-lääkkeitä ja jotka eivät saavuta täydellistä remissiota. Viimeaikaisten tutkimusten tapaan ehdotamme, että suoliston mikrobiotan modulointi voisi optimoida vastetulokset golimumabilla hoidetuilla potilailla.

Yhteenvetona voidaan todeta, että kirjallisuuden nykyisten suuntausten perusteella ehdotamme, että suoliston mikrobiotan modulaatiolla ja remissioihin liittyvien kuvioiden karakterisoinnilla on valtava vaikutus UC-potilaiden hoitoon. Lisäksi suoliston mikrobiotan modulointi yhdessä anti-TNF-lääkkeen tehokkuuden kanssa voisi olla lupaavin ala tulehduksellisen suolistosairauden hoidossa.

2. HYPOTEESI JA TAVOITTEET 2.1 Hypoteesi

1. Suoliston mikrobiotaprofiili muuttuu UC-aktiivisuuden mukaan.
2. Kliinisen remission kanssa korreloivaa suoliston mikrobiotaprofiilia edustaa vakaa suoliston mikrobiotan biologinen monimuotoisuus.
3. Arvioi, onko suolen mikrobisto hyödyllinen työkalu golimumabin tehokkuuden mittaamiseen potilailla, jotka eivät ole aiemmin saaneet anti-TNF-hoitoa, ja potilailla, jotka ovat saaneet toistuvasti anti-TNF-hoitoa.

2.2 Tavoitteet

1. Golimumabihoidon kliinisen remission korreloimiseksi normaalin suoliston mikrobiotaprofiilin biologisen monimuotoisuuden kanssa
2. Luonnehtia golimumabin käyttöön liittyvää suoliston mikrobiotan mallia ja mikrobien muutoksen ajallista dynamiikkaa.
3. Arvioi golimumabin vaikutus koliikkidysbioosin asteeseen hoidettaessa haavaista paksusuolitulehdusta, joka ei ole aiemmin ollut golimumabille.

3. MATERIAALIT JA MENETELMÄT 3.1 Tutkimuksen tyyppi/suunnittelu Monikeskus poikittainen pilottitutkimus 3.2 Tutkimuspopulaatio Ehdotettu tutkimus sisältää 15 UC-anti-TNF-potilasta, jotka eivät ole aiemmin saaneet UC-anti-TNF-potilasta Hospital Universitarista, tohtori Josep Truetalta. Tutkijat harkitsevat remissiota, kun potilaiden endoskooppinen Mayo-pistemäärä on ≤1 ja aktiivisuusindeksin pistemäärä Mayo = 0 pistettä.

3.3 Interventiot HUOMAA: "Potilaan osoittamista tiettyyn terapeuttiseen strategiaan ei määrätä etukäteen tutkimusprotokollasta, vaan kliinisestä käytännöstä. Lisäksi päätös tietyn lääkkeen määräämisestä on selvästi erillään päätöksestä ottaa potilas mukaan tutkimukseen. Potilaille ei tehdä muita kuin tavanomaisia ​​kliinisiä toimenpiteitä, olipa kyseessä diagnostinen tai seuranta, ja kerättyjen tietojen analysointiin tulee käyttää epidemiologisia menetelmiä."

3.3.1 Hoidot GOLIMUMAB-induktio 200 mg viikolla 0 ja 100 mg viikolla 2. Alle 80 kg painaville potilaille seurantahoito on kliinisen käytännön mukaan 50 mg/kk ja yli 80 kg painaville potilaille 100 mg/kk.

3.4 Muuttujat 3.4.1 Demografiset muuttujat

• Ikä ilmaistuna vuosina (y)
• Sukupuoli Mies (M) / Nainen (F)
• Painoindeksi
• Etninen: valkoihoinen / afrikkalainen / aasialainen / amerikkalainen
• Tupakka: KYLLÄ / EI / EX-Smoker
• UC-diagnoosin ikä ilmaistuna vuosina (y)
• Tutut esikuvat (KYLLÄ/EI) mikä sairaus?
• Lokalisointi vasen (L) / oikea (R) / laajennettu (E) 3.4.2 Kliiniset muuttujat
• Mayon klinikan pistemäärä (kliinisen paksusuolentulehduksen aktiivisuusindeksi) (Schroeder KW et ai. NEngl J Med 1987; 317: 1625-9). Pisteet: 0-9 pistettä
• CRP (C-reaktiivinen proteiini): veren C-reaktiivinen proteiinipitoisuus (mg/l)
• Ulosteen kalprotektiini: ulostenäyte ilmaistuna kalprotektiinin pitoisuutena ug/g ulostetta (ug/g)
• Vakioanalyysi:

Hemoglobiini: veren hemoglobiinipitoisuus (g / dl) Verihiutaleet: verihiutalepitoisuus (x103/ul) Leukosyytit: veren leukosyyttien pitoisuus (x103/ul) Albumiini: veren albumiinipitoisuus (g / dl) Kreatiniinitasot: veren kreatiniinipitoisuus (mg/ dl) ) 3.4.3 Endoskooppiset muuttujat • Mayo (ulceratiivisen paksusuolitulehduksen endoskooppinen pistemäärä) (Schroeder KW et al. 1987). Mayo Endoscopic Score perustuu vain endoskooppisiin löydöksiin. Mayo-pisteet vaihtelevat 0-3.

o Huomautus: Tutkijat lähettävät kuvan keskitetylle digitaaliselle alustalle, jossa 2 riippumatonta ammattilaista arvioi Mayo-pisteet, jotta voidaan minimoida tarkkailijoiden välinen harha.

3.4.4 Mikrobiologiset muuttujat

• Operational Taxonomic Units (OTU:t)
• Runsaus ja bakteerikuorma. 3.5 Menetelmät Ehdotetussa tutkimuksessa on mukana 15 yli 18-vuotiasta UC-potilasta, joilla on allekirjoitettu tietoinen suostumus ja joita hoidetaan anti-TNF:llä kliinisen käytännön mukaisesti. Kaikki heistä on tutkittu opportunististen infektioiden varalta. Potilaat ovat potilaita, jotka eivät ole aiemmin saaneet anti-TNF:ää.

Ulostenäytteet otetaan ennen anti-TNF-hoidon aloittamista (A) ja viikolla 4 (B), 9 (C), 13 (D), 26 (E), 39 (F) ja 52 (G) loppuun saattamiseksi. tutkimus. Seurantajakso on yksi vuosi. Tutkijat keräävät demografisia muuttujia (ikä, sukupuoli, tupakka, diagnoosin ikä, sijainti jne.), kliinisiä tietoja (osittainen Mayon kliininen pistemäärä, CRP, albumiini, hemoglobiini, kreatiniini, leukosyytit, verihiutaleet…) ja mikrobiologisia muuttujia kohdissa A, B , C, D, E, F ja G. Myös 7 kalprotektiininäytteenottoa (viikoilla 4 (B), 9 (C), 13 (D), 26 (E), 39 (F) ja 52 (G) kliininen käytäntö) ja Mayon endoskooppinen indeksi (lähtötilanteessa ja seurantajakson lopussa kliinisenä käytäntönä). Seurantakäyntejä tehdään myös rutiininomaisen kliinisen käytännön puitteissa. Jotta potilaan kehitystä voidaan seurata paremmin, tutkijat suorittavat rutiininomaiseen kliiniseen käytäntöön kuuluvia lisätestejä rektosigmoidoskopiana viikolla 12 Anti-TNF-hoidon aloittamisen jälkeen.

Tutkijat harkitsevat remissiota, kun potilaiden endoskooppinen Mayo-pistemäärä on ≤1 ja aktiivisuusindeksipiste, Mayon kliininen pistemäärä = 0 pistettä.

Lisäksi potilaan kehityksestä riippuen seurantajakson aikana suoritetaan myös lisätutkimuksia rutiininomaisena kliinisenä protokollana.

HUOMAA: Kaikki tutkimuksen ja/tai lisätestien aikana suoritetut testit ovat rutiininomaista kliinistä käytäntöä lääkärin kliinisen arvion ja kriteerien mukaisesti.

3.5.1 Näytteen käsittely

DNA:n erottaminen:

Ennen mikrobiologisia analyyseja 16s RNA-geenin genominen DNA uutetaan käyttämällä NucleoSpin® Soil Kit -pakkausta (Machery-Nagel GmbH & Co., Saksa). DNA-pitoisuus määritetään Qubit® BR (Invitrogen) Kit -sarjalla.

Bakteerien 16S-rRNA-geenin monistaminen pyrosekvensoinnilla Pyrosekvensointia varten 16S-rRNA-geeni monistettiin osittain uutetusta genomisesta DNA:sta käyttämällä yleisiä bakteerialukkeita GC-357F 5'- CGCCCG CCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCG1ACGCGGCCCGCCGCCCG1 5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3' (907Y926). PCR suoritettiin GeneAmp PCR System® 2700:lla (AppliedBiosystems)). Sitten puhdistamme PCR-tuotteen Ampure-sarjalla (Agencourt AMPure, Beckman Coulter Inc) ja kvantifioimme PCR-tuotteet Qubit® BR (Invitrogen) -sarjalla. Pyrosekvensointi suoritetaan 454 Life Genome Sciences Sequencer FLX -laitteella.

Sekvenssien muokkaus ja analyysi Korkealaatuiset konsensussekvenssit saadaan ja jalostetaan manuaalisesti Bioedit-ohjelmistopaketilla. Kohdistukset suoritettiin ClustalW24-ohjelmistolla. Konsensussekvenssejä verrattiin GenBankin ja Ribosomal Database Projectin vastaaviin käyttämällä BLASTN 2.2.10:tä. Sekvenssit ryhmitellään toimivien taksonomisten yksiköiden tai filotyyppien lukumäärän mukaan DOTUR-ohjelmalla26 käyttäen kaukaisimman naapurin menetelmää tarkkuustasolla 0,01, eli 99 %:n vähimmäissamankaltaisuus minkä tahansa sekvenssiparin osalta kuuluakseen samaan fylotyyppiin etäisyysmatriisissa Phylip-ohjelmistopaketin DNADIST-ohjelmalla lasketulla Jukes-Cantor-korjauksella.

3.6 Tilastollinen analyysi Tilastollinen analyysi suoritetaan SPSSx-versiolla 11.0. Ryhmien välisten etäisyyksien merkitys tarkistettiin varianssianalyysillä. Pearson_s x2 -testillä verrattiin suvun ja lajin esiintyvyyttä.

Kliiniset ja laboratoriotiedot korreloidaan kvantitatiivisten mikrobi-indeksien arvojen kanssa käyttämällä vastaanottimen toimintaominaisuus (ROC) käyriä.