Golimumab-effekt i moduleringen av tarmmikrobiota vid ulcerös kolit (GOLI2015)

Golimumab effekt vid modulering av tarmmikrobiota vid ulcerös kolit. Pilot studie.

1. BAKGRUND Nyligen indikerar en konsekvent mängd bevis att tarmmikrobiotans förmåga att modulera och styra värdens immunsvar anses vara en av de centrala faktorerna som modulerar den känsliga balansen mellan hälsa och sjukdom vid matsmältningssjukdomar. Vid inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) har tarmmikrobiotan en central roll för att upprätthålla patientens mikrobiologiska homeostas. Nyligen genomförda studier beskriver förekomsten av olika mönster av tarmmikrobiota från patienter med IBD och friska individer. Förändringen av det mikrobiologiska mönstret som inte är förknippat med sjukdom kallas dysbios och är direkt relaterat till graden av inflammation i tarmslemhinnan, och därmed klinikstatusen: en större dysbios, större klinisk korrelation med sjukdomstillståndet, så att tarmmikrobiota är en direkt markör för tillståndet av koloninflammation.

Tillståndet för dysbios mäts genom olika mikrobiologiska index för den totala populationen av bakterier i tjocktarmen. Förändringar i frekvensen av dessa index är de parametrar som mäts för att karakterisera tarmmikrobiotan hos patienterna. När det gäller ulcerös kolit (UC) har studier visat att tarmmikrobiota är en central faktor för att upprätthålla balansen mellan djup remission och förekomsten av en flare-up. Trots framsteg är djup kunskap om hur tarmmikrobiotan interagerar med tarmslemhinnan och förändrar tarmbarriären och den molekylära/genetiska mekanismen fortfarande okänd. Vissa gener och associerade kofaktorer har identifierats men den exakta mekanismen för interaktion har ännu inte beskrivits. Data indikerar att regleringsmekanismen förmodligen är en multifaktoriell process.

På detta sätt kommer en djup förståelse av tarmmikrobiota och dess interaktioner med värden och tjocktarmen att vara av stort intresse, för att forma framtiden för IBD-behandling, särskilt av UC. Således kan IBD-patienters tarmmikrobiota antingen vara ett terapeutiskt mål i sig (fekal transplantation) eller betraktas som ett justerbart adjuvans med immunmodulatorer. Gruppen av anti-TNF-läkemedel är de senast inkorporerade i den terapeutiska arsenalen av UC, i vissa fall förändras sjukdomens naturliga förbannelse. Det är dock fortfarande okänt hur dessa läkemedel modulerar tarmmikrobiotan och hur de stör den, även om de förmodligen utvecklar en roll. Nya resultat från studier av vår grupp indikerar att när man går in i klinisk remission modifieras tarmmikrobiota till mönster som är mindre relaterade till dysbios. Med tanke på den ökande betydelsen av användningen av anti-TNF-läkemedel är det av stort intresse att skilja mellan mönstren förknippade med dysbios och de relaterade till frisk slemhinna, och hur de modifieras som ett resultat av användningen av anti-TNF-läkemedel. På detta sätt har tidigare resultat från vår grupp som analyserar förändringar av tarmmikrobiota associerade med Adalimumab anti-TNF läkemedelsbehandling visat att under patientens progression till remission förändras mukosal dysbiosmönstret. Å andra sidan har vår grupp också observerat att efter misslyckad läkemedelsbehandling återgår tarmmikrobiotan till ett mönster som är närmare dysbios. Av den anledningen kan tarmmikrobiota betraktas som en utmärkt indikator på den verkliga läkemedelseffektiviteten hos patienten.

När det gäller Golimumab, en nyligen introducerad läkemedelsbehandling mot TNF i UC, är det fortfarande okänt hur det kan modulera tarmmikrobiotan till remissionsrelaterade mönster, eftersom det hittills inte finns tillgängliga studier om sambandet mellan Golimumab och detta fenomen.

Användningen av prebiotika och probiotika har visat viss effektivitet som adjuvans vid behandling av UC. Av den anledningen är ytterligare karakterisering av tarmmikrobiotamönstren mycket viktig för att utveckla nya strategier för adjuvans förmåga att modulera det, särskilt hos patienter som får anti-TNF-läkemedel och inte uppnår fullständig remission. I likhet med nyare studier föreslår vi att modulering av tarmmikrobiota kan optimera svarsresultaten hos patienter som behandlas med Golimumab.

Sammanfattningsvis, baserat på nuvarande trender i litteraturen, föreslår vi att modulering av tarmmikrobiotan och karakteriseringen av remissionsrelaterade mönster kommer att ha en enorm inverkan på hanteringen av patienter med UC. Dessutom kan moduleringen av tarmmikrobiota tillsammans med anti-TNF-läkemedlets effektivitet vara det mest lovande området för hantering av inflammatorisk tarmsjukdom.

2. HYPOTES OCH MÅL 2.1 Hypotes

1. Tarmmikrobiotaprofilen förändras enligt UC-aktivitet.
2. Den intestinala mikrobiotaprofilen korrelerad till klinisk remission representeras av stabil biodiversitet av tarmmikrobiota.
3. Bedöm om intestinal mikrobiota är ett användbart verktyg för att mäta Golimumabs effektivitet hos patienter som är naiva till anti-TNF-behandling och patienter som återkommer till anti-TNF-behandling.

2.2 Mål

1. Att korrelera klinisk remission under Golimumab-behandling med normal biologisk mångfald i tarmmikrobiotaprofilen
2. Att karakterisera mönstret av tarmmikrobiota i samband med användningen av Golimumab och temporär dynamik av mikrobiell förändring.
3. Bedöm effekten av golimumab på graden av kolikdysbios vid behandling av ulcerös kolit som är naiv för Golimumab.

3. MATERIAL OCH METODER 3.1 Typ av studie/design Multicenter transversal pilotstudie 3.2 Studiepopulation Den föreslagna studien kommer att inkludera 15 UC anti-TNF-naiva patienter från Hospital Universitari Dr. Josep Trueta. Utredarna kommer att överväga remission när patienter har en endoskopisk Mayo-poäng ≤1 och aktivitetsindexpoäng, Mayo = 0 poäng.

3.3 Interventioner OBS: "En patients tilldelning till en viss terapeutisk strategi är inte förutbestämd i förväg av studieprotokollet, istället av klinisk praxis. Dessutom är beslutet att förskriva ett visst läkemedel tydligt frikopplat från beslutet att inkludera patienten i studien. Patienter kommer inte att genomgå någon intervention, vare sig diagnostisk eller övervakning, annat än vanlig klinisk praxis, och epidemiologiska metoder ska användas för analys av insamlade data."

3.3.1 Behandlingar GOLIMUMAB-induktion med 200 mg vecka 0 och 100 mg vecka 2. Under 80 kg kommer uppföljningsbehandlingen att vara 50 mg/månad och 100 mg/månad hos patienter över 80 kg, enligt klinisk praxis.

3.4 Variabler 3.4.1 Demografiska variabler

• Ålder uttryckt i år (y)
• Kön Man (M)/Kvinna (F)
• Body mass Index
• Etnisk: kaukasisk/ afrikansk/ asiatisk/ amerikansk
• Tobak: JA / NEJ / EX-rökare
• Ålder för UC-diagnos uttryckt i år (y)
• Bekanta antecedenter (JA/NEJ) vilken typ av sjukdom?
• Lokalisering Vänster (L)/ Höger (R) / förlängd (E) 3.4.2 Kliniska variabler
• Mayo clinic score (Clinical colitis activity index) (Schroeder KW et al. NEngl J Med 1987; 317: 1625-9). Poängintervall: 0-9 poäng
• CRP (C-reaktivt protein): koncentration av C-reaktivt protein i blodet (mg/L)
• Fekalt kalprotektin: avföringsprov uttryckt i koncentration av kalprotektin i ug för g avföring (ug/g)
• Standardanalys:

Hemoglobin: blodets hemoglobinkoncentration (g/dl) Trombocyter: blodplättskoncentration (x103/ul) Leukocyter: blodets leukocytkoncentration (x103/ul) Albumin: blodalbuminkoncentration (g/dl) Kreatininnivåer: kreatininkoncentration i blodet (mg/dl) ) 3.4.3 Endoskopiska variabler • Mayo (Endoskopisk poäng för ulcerös kolit) (Schroeder KW et al. 1987). Mayo Endoscopic Score baseras endast på endoskopiska fynd. Mayo-poäng varierar från 0 till 3.

o Notera: Utredarna kommer att skicka bilden till en centraliserad digital plattform, där Mayo-poängen kommer att bedömas av två oberoende experter för att minimera partiskhet mellan observatörer.

3.4.4 Mikrobiologiska variabler

• Operationella taxonomiska enheter (OTU)
• Överflöd och bakteriell belastning. 3.5 Metoder Den föreslagna studien kommer att omfatta 15 UC-patienter över 18 år med undertecknat informerat samtycke, under behandling med anti-TNF enligt klinisk praxis. Alla kommer att ha screenats för opportunistiska infektioner. Patienterna kommer att vara anti-TNF-naiva patienter.

Avföringsprover kommer att samlas in innan anti-TNF-behandling (A) påbörjas och vid veckorna 4 (B), 9 (C), 13 (D), 26 (E), 39 (F) och 52 (G) för att slutföra studien. Övervakningsperioden kommer att vara ett år. Utredarna kommer att samla in demografiska variabler (ålder, kön, tobak, diagnosålder, lokalisering, ...), kliniska data (partiell Mayo klinisk poäng, CRP, albumin, hemoglobin, kreatinin, leukocyter, blodplättar ...) och mikrobiologiska variabler vid A, B , C, D, E, F och G. Även 7 calprotectin provtagning (vid vecka 4 (B), 9 (C), 13 (D), 26 (E), 39 (F) och 52 (G) som en klinisk praxis) och Mayo endoskopiska index (vid baslinjen och i slutet av övervakningsperioden som en klinisk praxis). Uppföljningsbesök kommer också att ske inom rutinmässig klinisk praxis. För bättre uppföljning av patientens utveckling kommer utredarna att utföra ytterligare tester som ingår i rutinmässig klinisk praxis som en rektosigmoidoskopi vid vecka 12 efter att ha påbörjat anti-TNF-behandling.

Utredarna kommer att överväga remission när patienter har en endoskopisk Mayo-poäng ≤1, och aktivitetsindexpoäng, Mayo-klinisk poäng = 0 poäng.

Beroende på patientens utveckling kommer dessutom ytterligare tester att utföras som rutinmässigt kliniskt protokoll under övervakningsperioden.

OBS: Alla tester som utförs under studien och/eller ytterligare tester är rutinmässig klinisk praxis enligt läkarens kliniska bedömning och kriterier.

3.5.1 Provbearbetning

DNA-extraktion:

Innan mikrobiologiska analyser kommer genomiskt DNA från 16s RNA-genen att extraheras med hjälp av NucleoSpin® Soil Kit (Machery-Nagel GmbH & Co., Tyskland). DNA-koncentrationen kommer att bestämmas med Qubit® BR (Invitrogen) Kit.

Bakteriell 16S rRNA-genamplifiering genom pyrosequencing För pyrosekvenseringsändamål amplifierades 16S rRNA-genen partiellt från extraherat genomiskt DNA med användning av de universella bakteriella primrarna GC-357F 5'- CGCCCG CCGCGCCCCGCGCCCGGCCCCG3-AGG3-AGG7-AGG7-AGG7-AGG7-AGG7-AGG7-AGG7-AGG7-AGG7 5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3' (907Y926). PCR utfördes med ett GeneAmp PCR System® 2700 (AppliedBiosystems)). Sedan renar vi PCR-produkten med kit Ampure (Agencourt AMPure, Beckman Coulter Inc), och kvantifierar PCR-produkterna med Qubit® BR (Invitrogen) Kit. Pyrosekvenseringen kommer att utföras med en 454 Life Genome Sciences Sequencer FLX.

Sekvensredigering och analys Konsensussekvenser av hög kvalitet kommer att erhållas och förfinas manuellt med mjukvarupaketet Bioedit. Justeringar utfördes med programvaran ClustalW24. Konsensussekvenser jämfördes med de i GenBank och Ribosomal Database Project genom att använda BLASTN 2.2.10. Sekvenser kommer att grupperas efter antal operativa taxonomiska enheter eller fylotyper med DOTUR-programmet26 med användning av metoden längst granne med en precisionsnivå på 0,01, dvs. 99 % minsta likhet för alla sekvenspar att tillhöra samma fylotyp, på en distansmatris med Jukes-Cantor-korrigeringen beräknad med programmet DNADIST i Phylips mjukvarupaket.

3.6 Statistisk analys Statistisk analys kommer att utföras med SPSSx version 11.0. Betydelsen av avstånden mellan grupperna kontrollerades med hjälp av en variansanalys. Pearsons x2-test användes för att jämföra förekomsten av släkt och art.

Kliniska och laboratoriedata kommer att korreleras med värdena för kvantitativa mikrobiella index med användning av Receiver Operating Characteristic (ROC) kurvor.