Koagulaasinegatiivisten stafylokokkien molekyylimarkkerin tunnistaminen proteettisten nivelinfektioiden diagnosointiin

Tehtävä 1.1: Nivelnestettä kerätään 60 potilaalta, jotka lähetettiin IRCCS Galeazzi Orthopedic Institute -instituuttiin septisen proteesin tarkistamista varten, ja 40 potilaalta, joille tehdään tarkistus aseptisen puutteen vuoksi. Kerätyt nivelnesteet säilytetään -80 °C:ssa analyysiin asti.

MSIS:n ohjeiden mukaan CRP- ja ESR-tasojen mittaus, nivelsolujen valkosolujen määrä sekä eksplantoidun laitteen ja periprosteettisen kudoksen mikrobiologinen viljely suoritetaan rutiinikäytäntöjä noudattaen. Vain nivelneste, joka on kerätty infektoituneen ryhmän potilailta, joilla on diagnosoitu CoNS:n välittämä PJI, on kelvollinen myöhempään proteomisiin analyyseihin. Tehtävä 1.2: Haetun CoNS-lajin vähintään 10 isolaatin eritys karakterisoidaan. Erityisesti kliinisiä CoNS-isolaatteja viljellään tippavirtausreaktorissa biofilmin tuotannon indusoimiseksi ja eritys analysoidaan, jotta voidaan suorittaa ensimmäinen kiinnostavien proteiinien valinta.

Tehtävä 2.1: PJI-potilaiden nivelnesteistä uutetut proteiinit karbamidomeyloidaan ja pilkotaan trypsiinillä. Sen jälkeen peptidiseokset analysoidaan nanonestekromatografialla, joka on kytketty tandem-massaspektrometriaan (nano LC-MS/MS). Label-free-kvantifiointia (LFQ) käytetään arvioimaan bakteerien ilmentämien ja potilaan nivelnesteissä erittyneiden proteiinien tasoa.

Tehtävä 2.2: Proteomisen ohjelmiston käyttö (esim. MaxQuant, Perseus jne.), bioinformaattinen analyysi suoritetaan sellaisten kiinnostavien proteiinien määrittämiseksi, joita esiintyy vain tartunnan saaneeseen potilasryhmään kuuluvissa näytteissä ja jotka ovat läheistä sukua bakteerien esiintymiseen.

Tehtävä 3.1: Kiinnostuksen kohteena olevat proteiinit, jotka on tunnistettu Tehtävässä 1.2 ja Tehtävässä 2.2 oletettuina CoNS-välitteisiin PJI:ihin liittyviksi biomarkkereiksi, valitaan kohdennettuihin proteomisiin analyyseihin lisäbioinformaattisten analyysien avulla.

Tehtävä 3.2: Tehtävässä 3.1 määriteltyjen oletettujen biomarkkerien läsnäolon vahvistamiseksi tutkimuspotilaiden nivelnesteessä kaikille tehtävässä 1.1 kerätyille infektoituneille/tartunnan saamattomille näytteille suoritetaan kohdennettu proteominen analyysi. Skyline-ohjelmisto valitsee prototyyppiset peptidit kullekin oletetulle biomarkkerille. Kaikkien ehdokaspeptidien ionisaatio- ja fragmentaatiokäyttäytymistä tutkitaan.

Tehtävä 3.3: Lopuksi kohdistetun proteomisen analyysin tiedot korreloidaan MSIS-ohjeiden mukaisesti laaditun diagnoosin tuloksiin kunkin valitun biomarkkerin diagnostisen arvon arvioimiseksi.