Identifizierung molekularer Marker von Koagulase-negativen Staphylokokken zur Diagnose von Gelenkprotheseninfektionen

Aufgabe 1.1: Synovialflüssigkeiten werden von 60 Patienten gesammelt, die zur Revision einer septischen Prothese an das IRCCS Galeazzi Orthopaedic Institute überwiesen wurden, und von 40 Patienten, die sich aufgrund eines aseptischen Versagens einer Revision unterziehen. Die gesammelten Synovialflüssigkeiten werden bis zur Analyse bei -80°C gelagert.

Gemäß den MSIS-Richtlinien werden die Messung der CRP- und ESR-Spiegel, der synovialen Leukozytenzahl und die mikrobiologische Kultur des explantierten Geräts und des periprothetischen Gewebes gemäß Routineprotokollen durchgeführt. Nur Synovialflüssigkeit, die von Patienten der infizierten Gruppe gesammelt wurde, bei der eine durch CoNS vermittelte PJI diagnostiziert wurde, ist für nachfolgende proteomische Analysen geeignet. Aufgabe 1.2: Das Sekretom von mindestens 10 Isolaten der gefundenen CoNS-Spezies wird charakterisiert. Insbesondere werden klinische CoNS-Isolate in einem Drip-Flow-Reaktor kultiviert, um die Produktion eines Biofilms zu induzieren, und das Sekretom wird analysiert, um die erste Auswahl von interessierenden Proteinen durchzuführen.

Aufgabe 2.1: Aus der Synovialflüssigkeit von Patienten mit oder ohne PJI extrahierte Proteine ​​werden carbamidomethyliert und durch Trypsin verdaut. Anschließend werden Peptidgemische mittels Nanoflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (Nano-LC-MS/MS) analysiert. Markierungsfreie Quantifizierungen (LFQ) werden angewendet, um die Proteinspiegel zu bestimmen, die von Bakterien exprimiert und in Synovialflüssigkeiten von Patienten sezerniert werden.

Aufgabe 2.2: Verwendung von proteomischer Software (d. h. MaxQuant, Perseus usw.) wird die bioinformatische Analyse durchgeführt, um einen Pool von interessierenden Proteinen zu bestimmen, der nur in Proben vorhanden ist, die zu der infizierten Patientengruppe gehören und die in engem Zusammenhang mit dem Vorhandensein von Bakterien stehen würden.

Aufgabe 3.1: Proteine ​​von Interesse, die in Aufgabe 1.2 und Aufgabe 2.2 als mutmaßliche Biomarker im Zusammenhang mit CoNS-vermittelten PJIs identifiziert wurden, werden für gezielte proteomische Analysen mittels zusätzlicher bioinformatischer Analysen ausgewählt.

Aufgabe 3.2: Um das Vorhandensein mutmaßlicher Biomarker, die in Aufgabe 3.1 definiert wurden, in der Synovialflüssigkeit von eingeschlossenen Patienten zu bestätigen, wird eine gezielte proteomische Analyse an allen in Aufgabe 1.1 gesammelten infizierten/nicht infizierten Proben durchgeführt. Prototypische Peptide für jeden mutmaßlichen Biomarker werden von der Skyline-Software ausgewählt. Das Ionisierungs- und Fragmentierungsverhalten aller Kandidatenpeptide wird untersucht.

Aufgabe 3.3: Schließlich werden die Informationen aus der gezielten proteomischen Analyse mit den Ergebnissen der gemäß den MSIS-Richtlinien formulierten Diagnose korreliert, um den diagnostischen Wert jedes ausgewählten Biomarkers zu bewerten.