Identifikation af molekylær markør for koagulase-negative stafylokokker til diagnosticering af protetiske ledinfektioner

Opgave 1.1: Synovialvæsker vil blive indsamlet fra 60 patienter henvist til IRCCS Galeazzi Orthopaedic Institute for revision af en septisk protese og fra 40 patienter, der gennemgår revision på grund af aseptisk svigt. De opsamlede ledvæsker vil blive opbevaret ved -80°C indtil analyse.

I henhold til MSIS-retningslinjerne vil måling af CRP- og ESR-niveauer, synovialt WBC-tal og den mikrobiologiske kultur af den eksplanterede enhed og det periprotetiske væv blive udført efter rutinemæssige protokoller. Kun synovialvæske indsamlet fra patienter i den inficerede gruppe diagnosticeret med en PJI medieret af CoNS vil være kvalificeret til efterfølgende proteomiske analyser. Opgave 1.2: Sekretomet af mindst 10 isolater af de udvundne arter af ConNS vil blive karakteriseret. Især vil CoNS kliniske isolater blive dyrket i en drypstrømsreaktor for at inducere produktionen af ​​biofilm, og sekretomet analyseres for at udføre det første udvalg af proteiner af interesse.

Opgave 2.1: Proteiner ekstraheret fra ledvæsker fra patienter med eller uden PJI vil blive carbamidomethyleret og fordøjet af trypsin. Derefter vil peptidblandinger blive analyseret ved nano væskekromatografi koblet til tandem massespektrometri (nano LC-MS/MS). Label-fri kvantificeringer (LFQ) vil blive anvendt til at vurdere niveauerne af proteiner udtrykt af bakterier og udskilt i patientens ledvæsker.

Opgave 2.2: Brug af proteomisk software (dvs. MaxQuant, Perseus, etc.), vil den bioinformatiske analyse blive udført for at bestemme en pool af proteiner af interesse, der kun er til stede i prøver, der tilhører den inficerede gruppe af patienter, og som ville være tæt forbundet med tilstedeværelsen af ​​bakterier.

Opgave 3.1: Proteiner af interesse identificeret i opgave 1.2 og opgave 2.2 som formodede biomarkører relateret til CoNS-medierede PJI'er vil blive udvalgt til målrettede proteomiske analyser ved hjælp af yderligere bioinformatiske analyser.

Opgave 3.2: For at bekræfte tilstedeværelsen af ​​formodede biomarkører defineret i Opgave 3.1 i ledvæske fra tilmeldte patienter, vil målrettet proteomisk analyse blive udført på alle de inficerede/ikke-inficerede prøver indsamlet i Opgave 1.1. Prototypiske peptider for hver formodet biomarkør vil blive udvalgt af Skyline-software. Ioniserings- og fragmenteringsadfærd af alle kandidatpeptider vil blive undersøgt.

Opgave 3.3: Endelig vil informationen fra den målrettede proteomiske analyse blive korreleret til resultaterne af diagnosen formuleret efter MSIS retningslinjerne for at evaluere den diagnostiske værdi af hver udvalgt biomarkør.