Identificación de marcador molecular de estafilococos coagulasa negativos para el diagnóstico de infecciones de prótesis articulares

Tarea 1.1: Se recolectarán líquidos sinoviales de 60 pacientes remitidos al IRCCS Galeazzi Orthopaedic Institute para la revisión de una prótesis séptica y de 40 pacientes sometidos a revisión por falla aséptica. Los líquidos sinoviales recogidos se almacenarán a -80 °C hasta su análisis.

De acuerdo con las pautas de MSIS, la medición de los niveles de CRP y ESR, el recuento de leucocitos sinoviales y el cultivo microbiológico del dispositivo explantado y el tejido periprotésico se realizarán siguiendo los protocolos de rutina. Solo el líquido sinovial recolectado de pacientes del grupo infectado diagnosticado con una IAP mediada por CoNS será elegible para análisis proteómicos posteriores. Tarea 1.2: Se caracterizará el secretoma de al menos 10 aislamientos de las especies recuperadas de CoNS. En particular, los aislados clínicos de CoNS se cultivarán en un reactor de flujo por goteo para inducir la producción de biopelícula y el secretoma se analizará para realizar la primera selección de proteínas de interés.

Tarea 2.1: Las proteínas extraídas de los líquidos sinoviales de pacientes con o sin IAP serán carbamidometiladas y digeridas por la tripsina. Posteriormente, las mezclas de péptidos se analizarán mediante nanocromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (nano LC-MS/MS). Se aplicarán cuantificaciones sin etiquetas (LFQ) para evaluar los niveles de proteínas expresadas por bacterias y secretadas en los líquidos sinoviales de los pacientes.

Tarea 2.2: Uso de software de proteómica (es decir, MaxQuant, Perseus, etc.), se realizará el análisis bioinformático para determinar un pool de proteínas de interés presente únicamente en muestras pertenecientes al grupo de pacientes infectados que estaría estrechamente relacionado con la presencia de bacterias.

Tarea 3.1: Las proteínas de interés identificadas en la Tarea 1.2 y la Tarea 2.2 como biomarcadores putativos relacionados con las IAP mediadas por CoNS se seleccionarán para análisis proteómicos específicos mediante análisis bioinformáticos adicionales.

Tarea 3.2: Para confirmar la presencia de biomarcadores putativos definidos en la Tarea 3.1 en el líquido sinovial de los pacientes inscritos, se realizará un análisis proteómico específico en todas las muestras infectadas/no infectadas recolectadas en la Tarea 1.1. Los péptidos prototípicos para cada biomarcador putativo serán seleccionados por el software Skyline. Se estudiarán los comportamientos de ionización y fragmentación de todos los péptidos candidatos.

Tarea 3.3: Finalmente, la información del análisis proteómico dirigido se correlacionará con los resultados del diagnóstico formulado siguiendo las pautas de MSIS para evaluar el valor diagnóstico de cada biomarcador seleccionado.