Identificazione del marcatore molecolare degli stafilococchi coagulasi-negativi per la diagnosi delle infezioni delle protesi articolari

Task 1.1: Saranno prelevati liquidi sinoviali da 60 pazienti indirizzati all'IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi per la revisione di una protesi settica e da 40 pazienti sottoposti a revisione per fallimento asettico. I fluidi sinoviali raccolti saranno conservati a -80°C fino al momento dell'analisi.

Secondo le linee guida MSIS, la misurazione dei livelli di PCR e VES, conta leucocitaria e la coltura microbiologica del dispositivo espiantato e del tessuto periprotesico saranno condotte seguendo i protocolli di routine. Solo il liquido sinoviale raccolto da pazienti del gruppo infetto con diagnosi di PJI mediato da CoNS sarà idoneo per le successive analisi proteomiche. Compito 1.2: Sarà caratterizzato il secretoma di almeno 10 isolati delle specie di CoNS recuperate. In particolare, gli isolati clinici di CoNS saranno coltivati ​​in un reattore a flusso gocciolante per indurre la produzione di biofilm e il secretoma analizzato per effettuare la prima selezione delle proteine ​​di interesse.

Compito 2.1: Le proteine ​​estratte dai liquidi sinoviali di pazienti con o senza PJI saranno carbammidometilate e digerite dalla tripsina. Successivamente, le miscele di peptidi saranno analizzate mediante nanocromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem (nano LC-MS/MS). Verranno applicate quantificazioni label-free (LFQ) per valutare i livelli di proteine ​​espresse dai batteri e secrete nei fluidi sinoviali dei pazienti.

Compito 2.2: Utilizzo del software proteomico (es. MaxQuant, Perseus, ecc.), verrà eseguita l'analisi bioinformatica per determinare un pool di proteine ​​di interesse presenti solo in campioni appartenenti al gruppo di pazienti infetti che sarebbero strettamente correlati alla presenza di batteri.

Compito 3.1: Le proteine ​​di interesse identificate nel Compito 1.2 e nel Compito 2.2 come biomarcatori putativi relativi a PJIs mediati da CoNS saranno selezionate per analisi proteomiche mirate mediante ulteriori analisi bioinformatiche.

Compito 3.2: Per confermare la presenza di presunti biomarcatori definiti nel Compito 3.1 nel liquido sinoviale dei pazienti arruolati, verrà eseguita un'analisi proteomica mirata su tutti i campioni infetti/non infetti raccolti nel Compito 1.1. I peptidi prototipali per ciascun biomarcatore putativo saranno selezionati dal software Skyline. Verranno studiati i comportamenti di ionizzazione e frammentazione di tutti i peptidi candidati.

Compito 3.3: Infine, le informazioni dall'analisi proteomica mirata saranno correlate ai risultati della diagnosi formulata seguendo le linee guida MSIS al fine di valutare il valore diagnostico di ciascun biomarcatore selezionato.