Identifiering av molekylär markör för koagulasnegativa stafylokocker för diagnos av ledprotesinfektioner

Uppgift 1.1: Ledvätska kommer att samlas in från 60 patienter som remitteras till IRCCS Galeazzi Orthopedic Institute för revision av en septisk protes och från 40 patienter som genomgår revision på grund av aseptisk misslyckande. De uppsamlade ledvätskorna kommer att förvaras vid -80°C fram till analys.

Enligt MSIS-riktlinjerna kommer mätningen av CRP- och ESR-nivåer, synovialt WBC-antal och den mikrobiologiska odlingen av den explanterade enheten och periprostetisk vävnad att utföras enligt rutinmässiga protokoll. Endast ledvätska som samlats in från patienter i den infekterade gruppen som diagnostiserats med en PJI medierad av CoNS kommer att vara berättigade för efterföljande proteomanalyser. Uppgift 1.2: Sekretomet av minst 10 isolat av de återvunna arterna av ConNS kommer att karakteriseras. I synnerhet kommer kliniska isolat från CoNS att odlas i en droppflödesreaktor för att inducera produktionen av biofilm och sekretomet analyseras för att utföra det första urvalet av proteiner av intresse.

Uppgift 2.1: Proteiner extraherade från ledvätskor hos patienter med eller utan PJI kommer att karbamidometyleras och smältas av trypsin. Därefter kommer peptidblandningar att analyseras med nanovätskekromatografi kopplat till tandemmasspektrometri (nano LC-MS/MS). Märkningsfria kvantifieringar (LFQ) kommer att användas för att bedöma nivåerna av proteiner som uttrycks av bakterier och utsöndras i patientens ledvätskor.

Uppgift 2.2: Använda proteomisk programvara (dvs. MaxQuant, Perseus, etc.), kommer den bioinformatiska analysen att utföras för att bestämma en pool av proteiner av intresse som endast finns i prover som tillhör den infekterade patientgruppen och som skulle vara nära besläktade med närvaron av bakterier.

Uppgift 3.1: Proteiner av intresse identifierade i Uppgift 1.2 och Uppgift 2.2 som förmodade biomarkörer relaterade till CoNS-medierade PJI kommer att väljas ut för riktade proteomiska analyser med hjälp av ytterligare bioinformatiska analyser.

Uppgift 3.2: För att bekräfta närvaron av förmodade biomarkörer definierade i uppgift 3.1 i ledvätskan hos inskrivna patienter, kommer riktad proteomisk analys att utföras på alla infekterade/icke-infekterade prover som samlats in i uppgift 1.1. Prototypiska peptider för varje förmodad biomarkör kommer att väljas ut av Skyline-mjukvaran. Joniserings- och fragmenteringsbeteenden av alla kandidatpeptider kommer att studeras.

Uppgift 3.3: Slutligen kommer informationen från den riktade proteomiska analysen att korreleras till resultaten av diagnosen som formulerats enligt MSIS-riktlinjerna för att utvärdera det diagnostiska värdet av varje vald biomarkör.