Identificatie van moleculaire marker van coagulase-negatieve stafylokokken voor de diagnose van prothetische gewrichtsinfecties

Taak 1.1: Gewrichtsvloeistoffen zullen worden afgenomen bij 60 patiënten die zijn doorverwezen naar IRCCS Galeazzi Orthopaedic Institute voor revisie van een septische prothese en bij 40 patiënten die revisie ondergaan wegens aseptisch falen. De verzamelde synoviale vloeistoffen worden tot analyse bij -80°C bewaard.

Volgens de MSIS-richtlijnen worden de meting van CRP- en ESR-niveaus, het aantal synoviale leukocyten en de microbiologische cultuur van het geëxplanteerde hulpmiddel en periprothetisch weefsel uitgevoerd volgens routineprotocollen. Alleen gewrichtsvloeistof die is verzameld van patiënten van de geïnfecteerde groep met de diagnose PJI gemedieerd door CoNS komt in aanmerking voor latere proteomische analyses. Taak 1.2: Het secretoom van ten minste 10 isolaten van de teruggevonden CoNS-soort zal worden gekarakteriseerd. In het bijzonder zullen klinische CoNS-isolaten worden gekweekt in een druppelstroomreactor om de productie van biofilm te induceren en het secretoom zal worden geanalyseerd om de eerste selectie van interessante eiwitten uit te voeren.

Taak 2.1: Eiwitten geëxtraheerd uit de synoviale vloeistoffen van patiënten met of zonder PJI worden gecarbamidomethyleerd en verteerd door trypsine. Daarna zullen peptidemengsels geanalyseerd worden door middel van nano vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem massaspectrometrie (nano LC-MS/MS). Labelvrije kwantificaties (LFQ) zullen worden toegepast om de niveaus van eiwitten te beoordelen die door bacteriën tot expressie worden gebracht en worden uitgescheiden in synoviale vloeistoffen van patiënten.

Taak 2.2: Proteomische software gebruiken (d.w.z. MaxQuant, Perseus, enz.), zal de bio-informatica-analyse worden uitgevoerd om een ​​pool van interessante eiwitten te bepalen die alleen aanwezig is in monsters die behoren tot de geïnfecteerde groep patiënten en die nauw verwant zou zijn aan de aanwezigheid van bacteriën.

Taak 3.1: Van belang zijnde eiwitten geïdentificeerd in Taak 1.2 en Taak 2.2 als vermeende biomarkers gerelateerd aan door CoNS gemedieerde PJI's zullen worden geselecteerd voor gerichte proteomische analyses door middel van aanvullende bioinformatische analyses.

Taak 3.2: Om de aanwezigheid van vermeende biomarkers gedefinieerd in Taak 3.1 in gewrichtsvloeistof van ingeschreven patiënten te bevestigen, zal gerichte proteomische analyse worden uitgevoerd op alle geïnfecteerde/niet-geïnfecteerde monsters die zijn verzameld in Taak 1.1. Prototypische peptiden voor elke vermeende biomarker zullen worden geselecteerd door Skyline-software. Ionisatie- en fragmentatiegedrag van alle kandidaat-peptiden zal bestudeerd worden.

Taak 3.3: Ten slotte zal de informatie van de gerichte proteomische analyse worden gecorreleerd met de uitkomsten van de diagnose die is geformuleerd volgens de MSIS-richtlijnen om de diagnostische waarde van elke geselecteerde biomarker te evalueren.