Identificação de Marcador Molecular de Estafilococos Coagulase-negativos para o Diagnóstico de Infecções de Próteses Articulares

Tarefa 1.1: Líquidos sinoviais serão coletados de 60 pacientes encaminhados ao IRCCS Galeazzi Orthopaedic Institute para a revisão de uma prótese séptica e de 40 pacientes submetidos a revisão devido a falha asséptica. Os fluidos sinoviais coletados serão armazenados a -80°C até a análise.

De acordo com as diretrizes do MSIS, a medição dos níveis de PCR e VHS, a contagem sinovial de leucócitos e a cultura microbiológica do dispositivo explantado e do tecido periprotético serão realizadas seguindo protocolos de rotina. Apenas o líquido sinovial coletado de pacientes do grupo infectado com diagnóstico de IAP mediada por CoNS será elegível para análises proteômicas subsequentes. Tarefa 1.2: O secretoma de pelo menos 10 isolados das espécies recuperadas de CoNS será caracterizado. Em particular, isolados clínicos de CoNS serão cultivados em um reator de gotejamento para induzir a produção de biofilme e o secretoma analisado para realizar a primeira seleção de proteínas de interesse.

Tarefa 2.1: Proteínas extraídas do líquido sinovial de pacientes com ou sem IAP serão carbamidometiladas e digeridas por tripsina. Posteriormente, as misturas de peptídeos serão analisadas por nanocromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas tandem (nano LC-MS/MS). Quantificações label-free (LFQ) serão aplicadas para avaliar os níveis de proteínas expressas por bactérias e secretadas no líquido sinovial dos pacientes.

Tarefa 2.2: Usando software proteômico (ou seja, MaxQuant, Perseus, etc.), a análise bioinformática será realizada para determinar um pool de proteínas de interesse presentes apenas em amostras pertencentes ao grupo de pacientes infectados que estariam intimamente relacionados à presença de bactérias.

Tarefa 3.1: Proteínas de interesse identificadas na Tarefa 1.2 e Tarefa 2.2 como biomarcadores putativos relacionados a PJIs mediados por CoNS serão selecionadas para análises proteômicas direcionadas por meio de análises bioinformáticas adicionais.

Tarefa 3.2: Para confirmar a presença de biomarcadores putativos definidos na Tarefa 3.1 no líquido sinovial dos pacientes inscritos, a análise proteômica direcionada será realizada em todas as amostras infectadas/não infectadas coletadas na Tarefa 1.1. Peptídeos prototípicos para cada biomarcador putativo serão selecionados pelo software Skyline. Serão estudados os comportamentos de ionização e fragmentação de todos os peptídeos candidatos.

Tarefa 3.3: Por fim, as informações da análise proteômica direcionada serão correlacionadas aos resultados do diagnóstico formulado seguindo as diretrizes do MSIS para avaliar o valor diagnóstico de cada biomarcador selecionado.