Identifikasjon av molekylær markør for koagulase-negative stafylokokker for diagnose av protetiske leddinfeksjoner

Oppgave 1.1: Synovialvæsker vil bli samlet inn fra 60 pasienter henvist til IRCCS Galeazzi Orthopedic Institute for revisjon av en septisk protese og fra 40 pasienter som gjennomgår revisjon på grunn av aseptisk svikt. De oppsamlede leddvæskene vil bli lagret ved -80°C frem til analyse.

I henhold til MSIS-retningslinjene vil måling av CRP- og ESR-nivåer, synovial WBC-telling og den mikrobiologiske kulturen av den eksplanterte enheten og periprostetisk vev bli utført etter rutineprotokoller. Kun leddvæske samlet inn fra pasienter i den infiserte gruppen diagnostisert med en PJI mediert av ConNS vil være kvalifisert for påfølgende proteomiske analyser. Oppgave 1.2: Sekretomet til minst 10 isolater av de hentede artene av ConNS vil bli karakterisert. Spesielt vil CoNS kliniske isolater bli dyrket i en dryppstrømsreaktor for å indusere produksjon av biofilm og sekretomet analyseres for å utføre det første utvalget av proteiner av interesse.

Oppgave 2.1: Proteiner ekstrahert fra leddvæsken til pasienter med eller uten PJI vil bli karbamidometylert og fordøyd av trypsin. Deretter vil peptidblandinger analyseres ved nanovæskekromatografi koblet til tandemmassespektrometri (nano LC-MS/MS). Etikettfrie kvantifiseringer (LFQ) vil bli brukt for å vurdere nivåene av proteiner uttrykt av bakterier og utskilt i pasientens leddvæsker.

Oppgave 2.2: Bruke proteomisk programvare (dvs. MaxQuant, Perseus, etc.), vil den bioinformatiske analysen bli utført for å bestemme en samling av proteiner av interesse som kun er tilstede i prøver som tilhører den infiserte pasientgruppen som vil være nært knyttet til tilstedeværelsen av bakterier.

Oppgave 3.1: Proteiner av interesse identifisert i Oppgave 1.2 og Oppgave 2.2 som antatte biomarkører relatert til CoNS-mediert PJI vil bli valgt for målrettede proteomiske analyser ved hjelp av ytterligere bioinformatiske analyser.

Oppgave 3.2: For å bekrefte tilstedeværelsen av antatte biomarkører definert i Oppgave 3.1 i leddvæske hos innrullerte pasienter, vil målrettet proteomisk analyse bli utført på alle infiserte/ikke-infiserte prøvene samlet i Oppgave 1.1. Prototypiske peptider for hver antatt biomarkør vil bli valgt av Skyline-programvaren. Ioniserings- og fragmenteringsadferd av alle kandidatpeptider vil bli studert.

Oppgave 3.3: Til slutt vil informasjonen fra den målrettede proteomiske analysen korreleres til resultatene av diagnosen formulert etter MSIS-retningslinjene for å evaluere den diagnostiske verdien av hver utvalgte biomarkør.