Identyfikacja markera molekularnego gronkowców koagulazo-ujemnych w diagnostyce zakażeń protetycznych stawów

Zadanie 1.1: Płyn stawowy zostanie pobrany od 60 pacjentów skierowanych do Instytutu Ortopedii IRCCS Galeazzi w celu rewizji protezy septycznej oraz od 40 pacjentów poddawanych rewizji z powodu niepowodzenia aseptycznego. Pobrany płyn maziowy będzie przechowywany w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Zgodnie z wytycznymi MSIS pomiary poziomu CRP i OB, liczby krwinek maziowych oraz hodowla mikrobiologiczna eksplantowanego urządzenia i tkanki okołoprotezowej zostaną przeprowadzone zgodnie z rutynowymi protokołami. Tylko płyn maziowy pobrany od pacjentów z grupy zakażonej, u których zdiagnozowano PJI za pośrednictwem CoNS, będzie kwalifikował się do kolejnych analiz proteomicznych. Zadanie 1.2: Scharakteryzowany zostanie sekretom co najmniej 10 izolatów pozyskanych gatunków CoNS. W szczególności kliniczne izolaty CoNS będą hodowane w reaktorze z przepływem kroplowym w celu wywołania produkcji biofilmu i analizy sekretomu w celu przeprowadzenia pierwszej selekcji białek będących przedmiotem zainteresowania.

Zadanie 2.1: Białka ekstrahowane z płynów maziowych pacjentów z PJI lub bez PJI będą karbamidometylowane i trawione trypsyną. Następnie mieszaniny peptydów będą analizowane metodą nanochromatografii cieczowej połączonej z tandemową spektrometrią mas (nano LC-MS/MS). Oznaczenia ilościowe bez znaczników (LFQ) zostaną zastosowane do oceny poziomów białek wyrażanych przez bakterie i wydzielanych w płynach maziowych pacjentów.

Zadanie 2.2: Korzystanie z oprogramowania proteomicznego (tj. MaxQuant, Perseus itp.) zostanie przeprowadzona analiza bioinformatyczna w celu określenia puli interesujących białek obecnych tylko w próbkach należących do zakażonej grupy pacjentów, które byłyby ściśle związane z obecnością bakterii.

Zadanie 3.1: Białka będące przedmiotem zainteresowania zidentyfikowane w Zadaniu 1.2 i Zadaniu 2.2 jako przypuszczalne biomarkery związane z PJI, w których pośredniczy CoNS, zostaną wybrane do ukierunkowanych analiz proteomicznych za pomocą dodatkowych analiz bioinformatycznych.

Zadanie 3.2: Aby potwierdzić obecność domniemanych biomarkerów określonych w zadaniu 3.1 w płynie maziowym włączonych pacjentów, zostanie przeprowadzona ukierunkowana analiza proteomiczna na wszystkich zakażonych/niezakażonych próbkach pobranych w zadaniu 1.1. Prototypowe peptydy dla każdego domniemanego biomarkera zostaną wybrane przez oprogramowanie Skyline. Zbadane zostaną zachowania jonizacyjne i fragmentacyjne wszystkich kandydujących peptydów.

Zadanie 3.3: Na koniec informacje z ukierunkowanej analizy proteomicznej zostaną skorelowane z wynikami diagnozy sformułowanej zgodnie z wytycznymi MSIS w celu oceny wartości diagnostycznej każdego wybranego biomarkera.