ApoB:tä sisältävien lipoproteiinien in vivo -aineenvaihdunta ANGPTL3-puutteellisilla potilailla

Työhypoteesi

Yleinen työhypoteesi on, että ANGPTL3:n normaali fysiologinen vaikutus on hidastaa lipolyysiä ja estää maksan jäännöspuhdistumaa. Tällä tavalla proteiini lisää VLDL:stä LDL-tiheysalueelle siirtyvien apoB-hiukkasten virtausta, mikä johtaa nettolisääntymiseen LDL:n tuotannossa. Aiemmissa tutkimuksissa havaitsimme, että VLDL:n muuntuminen IDL:ksi ja sitten LDL:ksi vaihtelee 25 %:sta 75 %:iin.2 Missä ja miten ANGPTL3 voisi toimia, jää selvittämättä. VLDL1- ja VLDL2-tuotannon nopeuksien, näiden hiukkasten lipolyysin nopeuksien ja IDL:ksi ja sitten LDL:ksi muunnetun apoB:n määrän vertailu kontrollihenkilöillä ja niillä, jotka ovat heterotsygoottisia ja homotsygoottisia ANGPTL3-funktion menettämisen (LOF) varianttien suhteen. meidän on rajattava, missä ANGPTL3 toimii, ja mahdollisesti paljastaa geeniannokseen liittyvä vaikutus.

Vaihtoehtoisia hypoteeseja tutkitaan myös, mukaan lukien mahdollisuus, että kiihtynyt kylomikronilipolyysi ANGPTL3 LOF:n kantajissa johtaa normaalia pienempään määrään ravinnon triglyseridiä maksaan, mikä tämän seurauksena heikentää VLDL:n muodostumista ja eritystä. Tämä viittaa siihen, että hypobetalipoproteinemian fenotyyppi johtuu ensisijaisesti maksan tuotannon poikkeavuudesta. Tai kuten äskettäin familiaalista hyperkolesterolemiaa koskevissa tutkimuksissa ehdotettiin, että LDL-katabolismi stimuloituu, kun ANGPTL3-aktiivisuus vähenee.

Ensisijaiset tavoitteet

Ensisijaisina tavoitteina on tutkia potilailla, jotka ovat heterotsygoottisia ja homotsygoottisia ANGPTL3 LOF -varianttien suhteen verrattuna vastaaviin kontrolleihin:

• ApoB48:n kinetiikka kylomikroneissa ja niiden jäännöksissä aikaisempien tutkimustemme valossa, jotka paljastivat aterian jälkeisen kylomikronemian dramaattisen vähenemisen homotsygoottisilla LOF-kantajilla.
• ApoB100:n kinetiikka VLDL1:ssä, VLDL2:ssa, IDL:ssä ja LDL:ssä. Tämä paljastaa tässä tilassa 4-6 havaitun hypobetalipoproteinemian perustan ja selventää, kuinka ANGPTL3:n osittainen tai täydellinen menetys johtaa VLDL-, jäännös- ja LDL-tasojen alenemiseen.
• TG:n kinetiikka VLDL1:ssä ja VLDL2:ssa. Tämä paljastaa, kuinka lipolyysi muuttuu, kun ANGPTL3:n toiminta on heikentynyt tai puuttuu.

Toissijaiset tavoitteet

Toissijaisena tavoitteemme on tutkia:

• ANGPTL3:n vaikutus keskeisten säätelyapolipoproteiinien apoC-III ja apoE kinetiikkaan, koska apoC-III:n on raportoitu olevan pienempi pitoisuudeltaan, kun ANGPTL3:aa vähennetään.
• ApoB:tä sisältävien lipoproteiinilajien yksityiskohtainen koostumus. Tutkimme kylomikronien, VLDL1:n, VLDL2:n, IDL:n ja LDL:n proteomisia ja lipidomisia profiileja tässä ainutlaatuisessa kohortissa ymmärtääksemme paremmin koostumuksen allekirjoituksia tässä erityisessä "matalan ASCVD-riskin" tilassa.

Kokeellinen suunnittelu ja lähestymistapa Kohteiden rekrytointi: Koehenkilöt rekrytoidaan heidän tunnetun asemansa perusteella S17X LOF -versiossa. Yksilöt ovat Campodimele-kylän asukkaita lähellä Roomaa Italiassa. Tutkijat ovat monien vuosien ajan luoneet läheisen ja molemminpuolisesti arvostetun yhteyden Camapodimelen asukkaisiin ja julkaisseet ANGPTL3 LOF:n kantajilla esiintyvän lipidifenotyypin keskeiset ominaisuudet. Tämä on syvällinen yhdistetty hypolipidemia, joka liittyy plasman kokonaispitoisuuksien alentumiseen. kolesteroli, TG, VLDL-TG ja kolesteroli, LDL-kolesteroli, apoB ja tylsistynyt aterian jälkeinen triglyseridivaste testirasvaiseen ateriaan. Suunnitelmamme on värvätä 4 saatavilla olevaa homotsygoottia ja tunnistaa 6-8 heterotsygoottia, joilla on alhainen ANGPTL3-pitoisuus plasmassa (<150 ng/ml) ja alhainen TG (<120 mg/dl). Campodimele-populaatiosta rekrytoidaan myös iän ja sukupuolen kanssa yhteensopivia terveitä kontrolleja (n=6-8), joilla ei ole tunnettuja lipidiaineenvaihduntaa häiritseviä tekijöitä.

Aineenvaihduntaprotokolla: Tutkijat ovat kehittäneet ja validoineet uusia menetelmiä, joiden avulla voidaan samanaikaisesti seurata TG:iden kinetiikkaa suuressa VLDL1:ssä ja pienemmässä VLDL2:ssa, apoB48:n kinetiikka kylomikroneissa, VLDL1:ssä ja VLDL2:ssa, apoB100:n VLDL1:ssä, VLDL2:ssa, IDL:n ja katabolin tuotantonopeudessa ja LDL:ssä apoC-III:lle ja apoE:lle. Koehenkilöt saavat 500 mg:n injektion deuteroitua glyserolia triglyseridikinetiikan arvioimiseksi ja deuteroitua leusiinia (7 mg/kg ruumiinpainoa) apoB100:n, apoB48:n, apoC-III:n ja apoE:n kinetiikan arvioimiseksi. Kylomikroniaineenvaihdunnan arvioimiseksi koehenkilöille tarjotaan tavallinen rasvainen ateria, joka sisältää 927 kcal (59,5 % rasvaa (68 g), 24,4 % hiilihydraattia (63 g) ja 15,5 % proteiinia (40 g) 2 tuntia isotooppien injektion jälkeen. Verinäytteet otetaan usein 8 tunnin ajan, minkä jälkeen otetaan lisää verinäytteitä seuraavana aamuna (24 tuntia) ja päivinä 2, 3 ja 4 merkkiaineen annon jälkeen. Kineettisen tutkimuksen aikana poistettavan veren kokonaismäärää (noin 350 ml) on vähennetty, koska osa tutkittavista (erityisesti homotsygootit) on iäkkäitä. (Tätä verenluovutuksen määrää pidetään hyväksyttävänä ja se on pienempi kuin mitä on kerätty aikaisemmissa kliinisissä tutkimuksissa tässä populaatiossa). Otetun veren määrän väheneminen ei muuta kykyämme saada kaikki kineettiset parametrit - Tutkijat hyödyntävät parhaalla mahdollisella tavalla erittäin herkkiä analyyttisiä tekniikoita. Tohtori Arcan kliininen tiimi suorittaa aineenvaihduntaprotokollan paikan päällä erityisissä kliinisissä tiloissa Campodimelessa. Näytteet viedään hänen laboratorioonsa Roomaan jaettavaksi ja lähetettäväksi. Lipoproteiinien eristäminen: Lipoproteiinifraktioiden eristäminen kineettistä analyysiä varten on aikaa vievää ja vaatii erikoislaitteita (ultrasentrifugeja) ja huomattavaa asiantuntemusta; TRL-fraktioiden eristäminen potilaista, joilla on alhainen plasman TG, on vieläkin haastavampaa. Lipoproteiinifraktioiden valmistus toteutetaan siksi Helsingissä tohtori Taskisen laboratoriossa (Roomasta jääkuljetuksen jälkeen). Kylomikronit, VLDL1, VLDL2, IDL ja LDL eristetään vakiintuneella vaiheittaisella keskipakomenetelmällä. Ensin kokonais-TRL konsentroidaan ultrasentrifugoimalla (d <1,006 g/ml 18 tunnin ajan) ja sitten tämä "yläosa" kerätään ja sitä käytetään kylomikronien (Sf >400), VLDL1:n (Sf 60-400) ja eristämiseen. VLDL2 (Sf 20-60) tiheysgradienttiultrasentrifugoinnilla. Fraktiota d> 1,006 g/ml ("pohja") käytetään IDL:n ja LDL:n erottamiseen peräkkäisissä sentrifugointivaiheissa. Näitä menetelmiä käytetään rutiininomaisesti Helsingin laboratoriossa. Eristetyt lipoproteiinifraktiot valmistetaan sitten siirrettäväksi Göteborgiin rikastusanalyysejä varten. Tämä valmistus sisältää TG:n, kolesterolin, fosfolipidien ja proteiinipitoisuuden mittaukset sekä lipidinpoiston, saostuksen ja apoB:n mittauksen. Apoproteiinien ja lipidien isotooppien rikastumisanalyysit ja matemaattinen mallintaminen: Kineettisen tutkimuksen seuraava vaihe on stabiilien isotooppien rikastumisen analyysi erittäin herkillä massaspektrometriamenetelmillä. Lipidien ja apolipoproteiinien (apoB100, apoB48, apoC-III ja apoE) pitoisuudet määritetään käyttämällä immunomääritys- ja massaspektrometriatekniikoita koko plasmassa ja lipoproteiinifraktioissa kullakin aineenvaihduntaprotokollan ajankohdalla. Isotooppirikastus apoproteiineilla ja lipideillä (triglyserideillä) suoritetaan GC/MS:llä. Kaikki nämä menetelmät, mukaan lukien näytteiden siirrot, ovat vakiintuneita ja vakiintuneita Helsingin ja Göteborgin laboratorioissa, ja niistä on julkaistu useita julkaisuja. Isotooppirikastustulokset ja TG/apoproteiinipitoisuudet kaikissa eristettyissä fraktioissa muodostavat tietojoukon, jolla moniosastoinen mallinnus suoritetaan. Tutkijat ovat onnistuneesti kehittäneet ja soveltaneet mallejamme dataan, joka on saatu eri sairauksista (hypertriglyseridemia, hypotriglyseridemia, diabetes) kärsivistä koehenkilöistä sekä lipidejä alentavasta hoidosta. Mallit soveltuvat kaikkiin havaittuihin asetuksiin, ja ne ovat tuottaneet uusia oivalluksia lipoproteiinien aineenvaihduntaan.12x-14 Moniosastoisista malleista johdetut kineettiset parametrit ovat: ApoB48-partikkelien tuotantonopeudet kylomikroni-, VLDL1- ja VLDL2-fraktioissa. ApoB100:n tuotantonopeudet VLDL1:ssä, VLDL2:ssa, IDL:ssä ja LDL:ssä. Lipolyysinopeudet TG:lle VLDL1:ssä ja VLDL2:ssa Fraktionaaliset puhdistumanopeudet apoB48:aa sisältäville hiukkasille kylomikroneissa, VLDL1, VLDL2 ja apoB100:aa sisältäville hiukkasille VLDL1:ssä, VLDL2:ssa, IDL:ssä ja LDL:ssä. Kylomikronien muuntumisnopeudet VLDL1:ksi ja VLDL2:ksi, VLDL1:n muuntumisnopeudet VLDL2:ksi IDL:ksi ja LDL:ksi. apoC-III:n ja apoE:n tuotanto- ja poistumisnopeudet.

Tärkeimmät tulostoimenpiteet ja tutkimustulokset. Sitä, kuinka ANGPTL3 säätelee lipoproteiinien aineenvaihduntaa ihmisillä, ei tunneta, ja siksi on tärkeää pitää avoin mieli sen tarkan toimintatavan suhteen apoB- ja TG-kinetiikkaan, kuten tässä tutkimuksessa on tutkittu. Tähän mennessä tehtyihin LOF-kantajista tehtyihin havaintoihin perustuva työhypoteesimme on, että sillä on vaikutus kaikkiin apoB:tä sisältäviin lipoproteiineihin, mikä eroaa muista säätelytekijöistä, kuten lipoproteiinien tuotantoa muuttavista tekijöistä - mikrosomaalisen triglyseridien siirtoproteiinin (MTP) aktiivisuudesta tai mutaatioista, jotka estävät VLDL1-kokoonpano (TM6SF2) tai ne, jotka muuttavat lipoproteiinireseptorivälitteistä puhdistumaa, kuten PCSK9.

Tutkijat ovat äskettäin julkaisseet tutkimuksen tekijöistä, jotka muuttavat apoB- ja TG-tuotantoa, kuten TM6SF2, PNPLA3 ja PCSK9:n rooli apoB:tä sisältävien lipoproteiinien katabolian säätelyssä. Lisäksi ja mikä tärkeintä, tutkijat ovat juuri viimeistelemässä kineettistä tutkimusta ryhmässä apoCIII LOF -kantajia, joilla on alhaiset TG-tasot ja muut fenotyyppiset ominaisuudet, jotka ovat verrattavissa ANGPTL3 LOF:ssa havaittuihin (vielä julkaisemattomiin). Näiden vertailututkimusten saatavuus tarjoaa metabolisen taustan, jota vasten voimme arvioida ANGPTL3:n erityisiä toimia.

Ensisijainen arviointi keskittyy eroihin VLDL1:n, VLDL2:n, IDL:n ja LDL:n puhdistumanopeuksissa, TG-lipolyysin nopeuksissa VLDL1:ssä ja VLDL2:ssa sekä VLDL1/VLDL2:n konversionopeuksiin IDL:ksi ja LDL:ksi homotsygoottisissa S17X-kantajissa verrattuna heterotsygootteihin. ja säätimet. Keskeinen tutkimuskysymys on: "Johtaako ANGPTL3:n puutos tai poissaolo lisääntyneeseen lipolyysiin ja lisääntyneeseen VLDL2:n ja IDL:n (LDL:n esiasteiden) fraktiopuhdistumanopeuteen, mikä sitten johtaa LDL-hiukkasten suonensisäisen muodostumisen vähenemiseen ja mahdollisesti jäännöksen verenkierron vähenemiseen lipoproteiinit". tutkija tutkii myös mahdollista geeniannosvaikutusta sisällyttämällä heterotsygootit tilastolliseen analyysiin. Tärkeimmät kineettiset parametrit testataan ANOVA-malleilla ja huomioidaan mahdolliset hämmentävät tekijät, kuten sukupuoli ja BMI.

Toissijainen hypoteesi, jonka mukaan ANGPTL3 vähentää maksan lipoproteiinien muodostumista ja eritystä, testataan suoraan vertaamalla VLDL1:n, VLDL2:n, IDL:n ja LDL apoB100:n tuotantonopeuksia sekä VLDL1-TG:n ja VLDL2-TG:n erittymisnopeutta näissä kolmessa. aiheryhmiä.

Muita tuloksia on kohdistaa proteominen ja lipidominen koostumustiedot kineettisten parametrien vaihteluun. Jos ANGPTL3 LOF -kantajilla on erittäin vähän jäännöspartikkeleita (ja muita aterogeenisiä lipoproteiineja), VLDL-fraktioiden, IDL- ja LDL-koostumus voi paljastaa "alhaisen riskin allekirjoituksen", joka on hyödyllinen arvioitaessa suunniteltujen aineiden tehokkuutta. vähentää tai estää ANGPTL3:n toimintaa.