ANGPTL3欠損被験者におけるapoB含有リポタンパク質のin vivo代謝

作業仮説

全体的な作業仮説は、ANGPTL3 の正常な生理学的作用は、脂肪分解を遅らせ、肝臓によるレムナント クリアランスを阻害することであるというものです。 このようにして、タンパク質は、VLDL から LDL 密度範囲に移行する apoB 粒子のフラックスを増加させ、LDL 産生の正味の増加をもたらします。 以前の研究では、VLDL から IDL への変換の程度、そして LDL への変換の程度が 25% から 75% まで変化することが観察されました.2 ANGPTL3 がどこでどのように機能するかは、まだ解明されていません。 VLDL1 と VLDL2 の生成速度、これらの粒子の脂肪分解速度、および対照被験者と ANGPTL3 機能喪失 (LOF) バリアントのヘテロ接合体およびホモ接合体における IDL および LDL に変換された apoB の量の比較が可能になります。 ANGPTL3 がどこで作用するかを明らかにし、おそらく遺伝子量に関連する効果を明らかにします。

また、ANGPTL3 LOFキャリアにおけるカイロミクロン脂肪分解の加速が、肝臓に送達される食事性トリグリセリドの量が正常以下になり、その結果、VLDLの組み立てと分泌が損なわれる可能性を含め、別の仮説も検討されます。 これは、低ベータリポタンパク血症の表現型が主に肝臓産生の異常によるものであることを意味します。 または、家族性高コレステロール血症の研究から最近示唆されたように、ANGPTL3 活性が低下すると LDL 異化作用が刺激されます。

主な目的

主な目的は、一致する対照と比較して、ANGPTL3 LOFバリアントのヘテロ接合体およびホモ接合体の被験者を調査することです。

• ホモ接合型 LOF 保因者における食後のカイロミクロン血症の劇的な減少を明らかにした以前の調査に照らして、カイロミクロンおよびその残骸における apoB48 の速度論.4
• VLDL1、VLDL2、IDL、および LDL における apoB100 の動態。 これにより、この状態で見られる低ベータリポタンパク血症の原因が明らかになり 4-6、ANGPTL3 の部分的または完全な喪失が VLDL、レムナント、および LDL のレベル低下にどのようにつながるかが明らかになります。
• VLDL1 および VLDL2 における TG の動態。 これにより、ANGPTL3 の作用が損なわれたり、欠如したりすると、脂肪分解がどのように変化するかが明らかになります。

副次的な目的

私たちの二次的な目的は、以下を調査することです。

• ANGPTL3が減少するとapoC-IIIの濃度が低くなることが報告されているため、重要な調節アポリポタンパク質であるapoC-IIIおよびapoEの動力学に対するANGPTL3の影響。
• apoB 含有リポタンパク質種の詳細な組成。 このユニークなコホートにおけるカイロミクロン、VLDL1、VLDL2、IDL、および LDL のプロテオミクスおよびリピドミクス プロファイルを調査し、この特定の「低 ASCVD リスク」状態における組成的特徴をさらに理解します。

実験計画とアプローチ 被験者の募集：被験者は、S17X LOFバリアントの既知の状態に基づいて募集されます。 個人は、イタリアのローマ近郊のカンポディメレ村の住民です。 研究者らは長年にわたり、カマポディメレの人々との緊密で相互に価値あるつながりを確立し、ANGPTL3 LOF を持つ人々によって示される脂質表現型の重要な特徴を発表しました。コレステロール、TG、VLDL-TG およびコレステロール、LDL コレステロール、apoB、および試験脂肪食に対する鈍化した食後トリグリセリド応答。 私たちの計画は、利用可能な 4 つのホモ接合体を募集し、ANGPTL3 血漿レベルが低く (<150ng/ml)、低い TG (<120mg/dl) を示す 6 ～ 8 のヘテロ接合体を特定することです。 脂質代謝を乱す既知の要因のない年齢と性別が一致した健康なコントロール (n = 6-8) も、カンポディメール集団から採用されます。

代謝プロトコル: 研究者は、大きな VLDL1 と小さな VLDL2 の TG、キロミクロンの apoB48、VLDL1 と VLDL2、VLDL1、VLDL2、IDL と LDL の apoB100、および生産速度と異化速度を同時に追跡できる新しい方法を開発し、検証しました。 apoC-III および apoE 用。 被験者は、重水素化グリセロールの 500 mg 注射を受けてトリグリセリドの動態を評価し、重水素化ロイシン (7 mg/kg 体重) を注射して apoB100、apoB48、apoC-III、および apoE の動態を評価します。 カイロミクロンの代謝を評価するために、同位元素の注射の 2 時間後に、927 kcal (脂肪 59.5 % (68 g)、炭水化物 24.4 % (63 g)、タンパク質 15.5 % (40 g)) を含む標準的な高脂肪食が被験者に提供されます。 血液サンプルを8時間頻繁に採取し、続いて翌朝（24時間）、およびトレーサー投与後2、3、および4日目にさらに血液サンプルを採取します。 速度論的研究の期間にわたって採取される総血液量 (約 350 ml) は、被験者の一部 (特にホモ接合体) が高齢であることを認識して減量されています。 (この量の献血は許容範囲内であると考えられており、この母集団における以前の臨床研究で収集された量を下回っています)。 採血量が減少しても、速度論的パラメータの完全なセットを導き出す能力が変わることはありません。研究者は、高感度の分析技術を最大限に活用します。 アルカ博士の臨床チームは、カンポディメレの特別な臨床施設で代謝プロトコルを実施します。 サンプルはローマにある彼の研究所に持ち込まれ、分注と出荷が行われます。 リポタンパク質の分離: 速度論的分析のためのリポタンパク質画分の分離には時間がかかり、特殊な装置 (超遠心分離機) とかなりの専門知識が必要です。血漿 TG が低い被験者から TRL 画分を分離することは、さらに困難です。 したがって、リポタンパク質画分の調製は、ヘルシンキのタスキネン博士の研究室で行われます（ローマから氷で輸送された後）。 キロミクロン、VLDL1、VLDL2、IDL、および LDL は、十分に確立された段階的な遠心手順で分離されます。 まず、総TRLを超遠心分離（d <1.006 g/mlで18時間）によって濃縮し、次にこの「トップ」画分を回収してカイロミクロン（Sf >400）、VLDL1（Sf 60-400）を分離するために使用します。 VLDL2 (Sf 20-60) 密度​​勾配超遠心法による。 d>1.006 g/ml (「下」) 画分を使用して、さらに連続した遠心分離ステップで IDL と LDL を分離します。 これらのメソッドは、ヘルシンキの研究室で日常的に採用されています。 分離されたリポタンパク質画分は、その後、濃縮分析のためにヨーテボリに転送するために準備されます。 この準備には、TG、コレステロール、リン脂質およびタンパク質濃度の測定、脱脂、沈殿、および apoB の測定が含まれます。 アポタンパク質と脂質の同位体濃縮の分析、および数学的モデリング: 動力学的調査の次のステップは、高感度の質量分析法を使用した安定同位体の濃縮の分析です。 脂質およびアポリポタンパク質 (apoB100、apoB48、apoC-III、および apoE) の濃度は、代謝プロトコルの各時点で全血漿およびリポタンパク質分画でイムノアッセイおよび質量分析技術を使用して決定されます。 アポタンパク質と脂質 (トリグリセリド) の同位体濃縮は、GC/MS を使用して実行されます。 サンプル転送を含むこれらの方法はすべて、ヘルシンキおよびヨーテボリのラボで堅牢で十分に確立されており、一連の出版物の対象となっています。 分離されたすべての画分における同位体濃縮結果と TG/アポタンパク質濃度は、マルチコンパートメント モデリングが行われるデータ セットを形成します。 研究者は、さまざまな状態 (高トリグリセリド血症、低トリグリセリド血症、糖尿病) および脂質低下治療のオン/オフの被験者から得られたデータにモデルを開発し、適用することに成功しました。 モデルは遭遇するすべての設定に適用可能であり、リポタンパク質代謝に関する新しい洞察を生み出しています.12x-14 マルチコンパートメント モデルから派生した動力学的パラメーターは次のとおりです。 VLDL1、VLDL2、IDL、およびLDLにおけるapoB100の産生率。 VLDL1 および VLDL2 における TG の脂肪分解率 カイロミクロン、VLDL1、VLDL2 における apoB48 含有粒子、および VLDL1、VLDL2、IDL および LDL における apoB100 含有粒子のフラクショナルクリアランス率。 カイロミクロンから VLDL1 および VLDL2 への変換率、VLDL1 から VLDL2 から IDL および LDL への変換率。 apoC-III および apoE の産生およびクリアランス率。

主な結果の測定値と研究の成果物。 ANGPTL3 がヒトのリポタンパク質代謝をどのように調節するかは不明であるため、この研究で調査したように、apoB および TG 動力学に対するその正確な作用機序について、心を開いておくことが重要です。 LOFキャリアにおけるこれまでの観察に基づく我々の作業仮説は、リポタンパク質産生を変化させるもの、ミクロソームトリグリセリド転移（MTP）タンパク質活性または阻害する突然変異などの他の調節因子とは異なる、すべてのapoB含有リポタンパク質に影響を与えるということです。 VLDL1 アセンブリ (TM6SF2)、または PCSK9 などのリポタンパク質受容体を介したクリアランスを変更するもの。

研究者らは最近、TM6SF2、PNPLA3、および apoB 含有リポタンパク質の異化作用の制御における PCSK9 の役割など、apoB および TG の生成を変更する要因の研究を発表しました。 さらに、そして重要なことに、研究者は、ANGPTL3 LOFで見られるものに匹敵する低TGレベルおよび他の表現型特性を示すapoCIII LOFキャリアのグループでの速度論的研究を完了したところです（まだ公開されていません）。 これらの比較研究の利用可能性は、ANGPTL3 の特定のアクションを評価できる代謝の背景を提供します。

一次評価では、VLDL1、VLDL2、IDL、および LDL クリアランス率の違い、VLDL1 および VLDL2 における TG 脂肪分解率、およびヘテロ接合体と比較したホモ接合体 S17X キャリアにおける VLDL1/VLDL2 から IDL および LDL への変換率に焦点を当てます。とコントロール。 重要な研究課題は、「ANGPTL3 の欠損または欠損により、脂肪分解が増加し、VLDL2 および IDL (LDL の前駆体) のフラクショナル クリアランス率が増加し、血管内での LDL 粒子の生成が減少し、おそらく循環レムナントのレベルが減少するか?リポタンパク質」。研究者はまた、統計分析にヘテロ接合体を含めることにより、潜在的な遺伝子量効果を調査します。 性別やBMIなどの潜在的な交絡因子を含めて、ANOVAモデルで主要な速度パラメータをテストします。

ANGPTL3 が肝臓での全体的なリポタンパク質の集合と分泌を減少させるように作用するという二次仮説は、VLDL1、VLDL2、IDL および LDL apoB100 の産生率、ならびに 3 種類の VLDL1-TG および VLDL2-TG の分泌率を比較することによって直接テストされます。対象グループ。

さらなる成果は、プロテオミクスおよびリピドミクスの組成データを速度論的パラメーターの変動に合わせることです。 ANGPTL3 LOFキャリアが非常に低いレベルの残存粒子（および他のアテローム形成リポタンパク質）を持っている場合、VLDL画分、IDLおよびLDLの組成は、設計された薬剤の有効性を評価するときに役立つ「低リスクシグネチャ」を明らかにする可能性があります。 ANGPTL3 作用を低下または阻害します。