Metabolismo in vivo de lipoproteínas que contienen apoB en sujetos con deficiencia de ANGPTL3

Hipótesis de trabajo

La hipótesis de trabajo general es que la acción fisiológica normal de ANGPTL3 es retardar la lipólisis e inhibir la eliminación de restos por parte del hígado. De esta forma, la proteína provoca un aumento en el flujo de partículas de apoB que transitan desde el rango de densidad de VLDL al de LDL, lo que resulta en un aumento neto en la producción de LDL. En estudios previos observamos que el grado de conversión de VLDL a IDL y luego a LDL varía del 25% al ​​75%2. Queda por descubrir dónde y cómo podría actuar ANGPTL3. Una comparación de las tasas de producción de VLDL1 y VLDL2, las tasas de lipólisis de estas partículas y la cantidad de apoB convertida en IDL y luego en LDL en sujetos de control y aquellos heterocigotos y homocigotos para las variantes de pérdida de función (LOF) de ANGPTL3 permitirá nosotros para delinear dónde actúa ANGPTL3, y posiblemente revelar un efecto relacionado con la dosis del gen.

También se explorarán hipótesis alternativas, incluida la posibilidad de que la lipólisis de quilomicrones acelerada en los portadores de LOF de ANGPTL3 conduzca a una cantidad inferior a la normal de triglicéridos dietéticos que se entregan al hígado, lo que como resultado afecta el ensamblaje y la secreción de VLDL. Esto implicaría que el fenotipo de hipobetalipoproteinemia se debe principalmente a una anomalía en la producción hepática. O, como se sugirió recientemente a partir de estudios en hipercolesterolemia familiar, que hay una estimulación del catabolismo de LDL cuando se reduce la actividad de ANGPTL3.

Objetivos principales

Los objetivos principales son investigar en sujetos heterocigotos y homocigotos para variantes de LOF de ANGPTL3 en comparación con controles emparejados:

• Cinética de apoB48 en quilomicrones y sus remanentes a la luz de nuestras investigaciones anteriores que revelaron reducciones dramáticas en la quilomicronemia posprandial en portadores homocigóticos de LOF.4
• Cinética de apoB100 en VLDL1, VLDL2, IDL y LDL. Esto revelará la base de la hipobetalipoproteinemia observada en esta condición 4-6 y aclarará cómo la pérdida parcial o completa de ANGPTL3 conduce a niveles más bajos de VLDL, remanentes y LDL.
• Cinética de TG en VLDL1 y VLDL2. Esto revelará cómo se altera la lipólisis cuando la acción de ANGPTL3 está alterada o ausente.

Objetivos secundarios

Nuestros objetivos secundarios son investigar:

• El impacto de ANGPTL3 en la cinética de las apolipoproteínas reguladoras clave apoC-III y apoE, ya que se ha informado que la concentración de apoC-III es menor cuando se reduce ANGPTL3.
• La composición detallada de las especies de lipoproteínas que contienen apoB. Exploraremos los perfiles proteómicos y lipidómicos de quilomicrones, VLDL1, VLDL2, IDL y LDL en esta cohorte única para comprender mejor las firmas de composición en esta condición específica de "bajo riesgo de ASCVD".

Enfoque y diseño experimental Reclutamiento de sujetos: los sujetos se reclutarán en función de su estado conocido para la variante S17X LOF. Los individuos son habitantes del pueblo de Campodimele, cerca de Roma, Italia. Durante muchos años, los investigadores han establecido una conexión estrecha y de valor mutuo con la gente de Camapodimele y han publicado características clave del fenotipo lipídico que exhiben quienes portan el LOF ANGPTL3, que es una hipolipidemia combinada profunda asociada con niveles plasmáticos reducidos de colesterol, TG, VLDL-TG y colesterol, colesterol LDL, apoB y una respuesta atenuada de triglicéridos posprandiales a una comida rica en grasas de prueba. Nuestro plan es reclutar los 4 homocigotos disponibles e identificar 6-8 heterocigotos que muestren niveles plasmáticos bajos de ANGPTL3 (<150 ng/ml) y TG bajos (<120 mg/dl). Controles sanos emparejados por edad y sexo (n = 6-8) sin factores conocidos que perturben el metabolismo de los lípidos también serán reclutados de la población de Campodimele.

Protocolo metabólico: los investigadores han desarrollado y validado métodos novedosos que permiten seguir simultáneamente la cinética de los TG en VLDL1 grande y VLDL2 más pequeña, apoB48 en quilomicrones, VLDL1 y VLDL2, apoB100 en VLDL1, VLDL2, IDL y LDL, y las tasas de producción y catabólicas para apoC-III y apoE. Los sujetos recibirán una inyección de 500 mg de glicerol deuterado para evaluar la cinética de triglicéridos y una inyección de leucina deuterada (7 mg/kg de peso corporal) para evaluar la cinética de apoB100, apoB48, apoC-III y apoE. Para evaluar el metabolismo de los quilomicrones, a los sujetos se les servirá una comida estándar rica en grasas que contenga 927 kcal (59,5 % de grasa (68 g), 24,4 % de carbohidratos (63 g) y 15,5 % de proteína (40 g) 2 horas después de la inyección de isótopos. Se tomarán muestras de sangre en puntos de tiempo frecuentes durante 8 horas, seguidas de muestras de sangre adicionales recolectadas a la mañana siguiente (24 horas) y los días 2, 3 y 4 después de la administración del marcador. El volumen de sangre total a extraer durante el período del estudio cinético (alrededor de 350 ml) se ha reducido en reconocimiento de que algunos de los sujetos (en particular homocigotos) son ancianos. (Este volumen de donación de sangre se considera aceptable y está por debajo de lo recogido en estudios clínicos anteriores en esta población). La reducción de la extracción de sangre no altera nuestra capacidad para derivar el conjunto completo de parámetros cinéticos: los investigadores harán el mejor uso de las técnicas analíticas altamente sensibles. El equipo clínico del Dr. Arca realizará el protocolo metabólico en el sitio en instalaciones clínicas especiales en Campodimele. Las muestras se llevarán a su laboratorio en Roma para su alicuotación y envío. Aislamiento de lipoproteínas: el aislamiento de fracciones de lipoproteínas para el análisis cinético lleva mucho tiempo y requiere equipo especializado (ultracentrífugas) y experiencia considerable; aislar fracciones de TRL de sujetos con niveles bajos de TG en plasma es aún más desafiante. Por lo tanto, la preparación de las fracciones de lipoproteínas se llevará a cabo en el laboratorio del Dr. Taskinen en Helsinki (después del envío en hielo desde Roma). Los quilomicrones, VLDL1, VLDL2, IDL y LDL se aislarán en un procedimiento centrífugo paso a paso bien establecido. Primero, la TRL total se concentrará mediante ultracentrifugación (d <1,006 g/ml durante 18 horas) y luego esta fracción "superior" se recolectará y usará para aislar quilomicrones (Sf >400), VLDL1 (Sf 60-400) y VLDL2 (Sf 20-60) por ultracentrifugación en gradiente de densidad. La fracción d>1,006 g/ml ('inferior') se utilizará para separar IDL y LDL en pasos de centrifugación secuenciales adicionales. Estos métodos se emplean de forma rutinaria en el laboratorio de Helsinki. Las fracciones de lipoproteínas aisladas se preparan luego para transferirlas a Gotemburgo para análisis de enriquecimiento. Esta preparación implica mediciones de TG, colesterol, fosfolípidos y concentración de proteínas, y delipidación, precipitación y medición de apoB. Análisis de enriquecimientos de isótopos en apoproteínas y lípidos, y modelado matemático: El siguiente paso en la investigación cinética es el análisis del enriquecimiento de isótopos estables utilizando métodos de espectrometría de masas de alta sensibilidad. Las concentraciones de lípidos y apolipoproteínas (apoB100, apoB48, apoC-III y apoE) se determinarán mediante técnicas de inmunoensayo y espectrometría de masas en plasma total y en fracciones de lipoproteínas en cada momento del protocolo metabólico. El enriquecimiento de isótopos en apoproteínas y lípidos (triglicéridos) se realizará mediante GC/MS. Todos estos métodos, incluidas las transferencias de muestras, son sólidos y están bien establecidos en los laboratorios de Helsinki y Gotemburgo, y han sido objeto de una serie de publicaciones. Los resultados del enriquecimiento de isótopos y las concentraciones de TG/apoproteína en todas las fracciones aisladas forman el conjunto de datos sobre el que se realiza el modelado multicompartimental. Los investigadores han desarrollado y aplicado con éxito nuestros modelos a los datos derivados de sujetos con una variedad de condiciones (hipertrigliceridemia, hipotrigliceridemia, diabetes), así como con y sin tratamiento hipolipemiante. Los modelos son aplicables a todos los entornos encontrados y han generado nuevos conocimientos sobre el metabolismo de las lipoproteínas.12x-14 Los parámetros cinéticos derivados de los modelos multicompartimentales son: Tasas de producción de partículas apoB48 en las fracciones de quilomicrones, VLDL1 y VLDL2. Tasas de producción de apoB100 en VLDL1, VLDL2, IDL y LDL. Tasas de lipólisis para TG en VLDL1 y VLDL2 Tasas de aclaramiento fraccional para partículas que contienen apoB48 en quilomicrones, VLDL1, VLDL2, y para partículas que contienen apoB100 en VLDL1, VLDL2, IDL y LDL. Tasas de conversión de quilomicrones a VLDL1 y VLDL2, tasas de conversión de VLDL1 a VLDL2 a IDL ya LDL. Tasas de producción y eliminación de apoC-III y apoE.

Principales medidas de resultados y entregables del estudio. Se desconoce cómo ANGPTL3 regula el metabolismo de las lipoproteínas en humanos y, por lo tanto, es importante mantener la mente abierta en cuanto a su modo de acción preciso sobre la cinética de apoB y TG como se explora en este estudio. Nuestra hipótesis de trabajo basada en observaciones hasta la fecha en portadores de LOF es que tiene un impacto en todas las lipoproteínas que contienen apoB que es distinto de otros factores reguladores, como los que alteran la producción de lipoproteínas: la actividad de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomales (MTP) o mutaciones que inhiben Ensamblaje de VLDL1 (TM6SF2), o aquellos que alteran la eliminación mediada por el receptor de lipoproteínas, como PCSK9.

Los investigadores han publicado recientemente investigaciones sobre los factores que alteran la producción de apoB y TG, como TM6SF2, PNPLA3 y el papel de PCSK9 en el control del catabolismo de las lipoproteínas que contienen apoB. Además, y lo que es más importante, los investigadores acaban de completar un estudio cinético en un grupo de portadores de LOF de apoCIII que exhiben niveles bajos de TG y otros rasgos fenotípicos comparables a los observados en ANGPTL3 LOF (aún sin publicar). La disponibilidad de estos estudios de comparación proporciona un trasfondo metabólico contra el cual podemos evaluar las acciones específicas de ANGPTL3.

La evaluación principal se centrará en las diferencias en las tasas de eliminación de VLDL1, VLDL2, IDL y LDL, las tasas de lipólisis de TG en VLDL1 y VLDL2, y las tasas de conversión de VLDL1/VLDL2 en IDL y LDL en los portadores homocigóticos de S17X en comparación con los heterocigóticos. y controles La pregunta clave de la investigación es "¿la deficiencia o ausencia de ANGPTL3 da como resultado un aumento de la lipólisis y un aumento de las tasas de aclaramiento fraccional de VLDL2 e IDL (los precursores de LDL), lo que luego conduce a una reducción de la generación intravascular de partículas de LDL y posiblemente a una reducción en el nivel circulante de partículas remanentes? lipoproteínas". el investigador también explorará un posible efecto de dosis génica al incluir heterocigotos en el análisis estadístico. Los parámetros cinéticos clave se probarán en modelos ANOVA, con la inclusión de posibles factores de confusión como el sexo y el IMC.

la hipótesis secundaria de que ANGPTL3 actúa para reducir el ensamblaje y la secreción total de lipoproteínas en el hígado se probará directamente comparando las tasas de producción de VLDL1, VLDL2, IDL y LDL apoB100, y la tasa de secreción de VLDL1-TG y VLDL2-TG en los tres grupos de materias.

Otros resultados serán alinear los datos de composición proteómica y lipidómica con la variación en los parámetros cinéticos. Si es el caso que los portadores de LOF de ANGPTL3 tienen niveles muy bajos de partículas remanentes (y otras lipoproteínas aterogénicas), entonces la composición de las fracciones de VLDL, IDL y LDL puede revelar una "firma de bajo riesgo" que es útil al evaluar la eficacia de los agentes diseñados para reducir o inhibir la acción de ANGPTL3.