In vivo metabolisme van apoB-bevattende lipoproteïnen bij ANGPTL3-deficiënte proefpersonen

Werkhypothese

De algemene werkhypothese is dat de normale fysiologische werking van ANGPTL3 is om de lipolyse te vertragen en de klaring van restanten door de lever te remmen. Op deze manier veroorzaakt het eiwit een toename van de flux van apoB-deeltjes die van het VLDL- naar het LDL-dichtheidsbereik gaan, wat resulteert in een netto toename van de LDL-productie. In eerdere studies zagen we dat de mate van conversie van VLDL naar IDL en vervolgens LDL varieert van 25% tot 75%.2 Waar en hoe ANGPTL3 zou kunnen werken, moet nog worden ontdekt. Een vergelijking van de snelheden van VLDL1- en VLDL2-productie, snelheden van lipolyse van deze deeltjes en de hoeveelheid apoB omgezet in IDL en vervolgens LDL bij controlepersonen en degenen die heterozygoot en homozygoot zijn voor ANGPTL3 loss-of-function (LOF)-varianten zal het mogelijk maken ons om af te bakenen waar ANGPTL3 werkt, en mogelijk een gendosisgerelateerd effect te onthullen.

Alternatieve hypothesen zullen ook worden onderzocht, waaronder de mogelijkheid dat versnelde chylomicron-lipolyse in ANGPTL3 LOF-dragers ertoe leidt dat een subnormale hoeveelheid voedingstriglyceride aan de lever wordt afgegeven, wat als resultaat de VLDL-assemblage en -secretie schaadt. Dit zou impliceren dat het fenotype hypobetalipoproteïnemie voornamelijk te wijten is aan een afwijking in de leverproductie. Of, zoals onlangs gesuggereerd uit onderzoeken naar familiaire hypercholesterolemie, dat er een stimulatie van LDL-katabolisme is wanneer de ANGPTL3-activiteit wordt verminderd.

Primaire doelen

De primaire doelstellingen zijn het onderzoeken bij proefpersonen die heterozygoot en homozygoot zijn voor ANGPTL3 LOF-varianten in vergelijking met gematchte controles:

• Kinetiek van apoB48 in chylomicronen en hun overblijfselen in het licht van onze eerdere onderzoeken die dramatische verminderingen van postprandiale chylomicronemie bij homozygote LOF-dragers aan het licht brachten.4
• Kinetiek van apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL en LDL. Dit zal de basis onthullen voor de hypobetalipoproteïnemie die wordt gezien in deze aandoening 4-6 en verduidelijken hoe gedeeltelijk of volledig verlies van ANGPTL3 leidt tot lagere niveaus van VLDL, restanten en LDL.
• Kinetiek van TG in VLDL1 en VLDL2. Dit zal onthullen hoe lipolyse wordt veranderd wanneer de ANGPTL3-actie wordt aangetast of afwezig is.

Secundaire doelstellingen

Onze secundaire doelstellingen zijn het onderzoeken van:

• De impact van ANGPTL3 op de kinetiek van de belangrijkste regulerende apolipoproteïnen apoC-III en apoE, aangezien is gerapporteerd dat apoC-III een lagere concentratie heeft wanneer ANGPTL3 wordt verlaagd.
• De gedetailleerde samenstelling van apoB-bevattende lipoproteïnesoorten. We zullen de proteomische en lipidomische profielen van chylomicronen, VLDL1, VLDL2, IDL en LDL in dit unieke cohort onderzoeken om de samenstellingshandtekeningen in deze specifieke aandoening met 'laag ASCVD-risico' verder te begrijpen.

Proefopzet en aanpak Werving proefpersonen: proefpersonen worden geworven op basis van hun bekende status voor de S17X LOF-variant. De individuen zijn inwoners van het dorp Campodimele, nabij Rome, Italië. De onderzoekers hebben gedurende vele jaren een nauwe en wederzijds gewaardeerde band opgebouwd met de mensen van Camapodimele en hebben de belangrijkste kenmerken gepubliceerd van het lipidenfenotype dat wordt vertoond door degenen die de ANGPTL3 LOF dragen, wat een diepgaande gecombineerde hypolipidemie is die gepaard gaat met verlaagde plasmaspiegels van totaal cholesterol, TG, VLDL-TG en cholesterol, LDL-cholesterol, apoB en een afgestompte postprandiale triglyceriderespons op een vettestmaaltijd. Ons plan is om de 4 beschikbare homozygoten te werven en 6-8 heterozygoten te identificeren die lage ANGPTL3-plasmaspiegels (<150ng/ml) en lage TG (<120mg/dl) vertonen. Gezonde controles die qua leeftijd en geslacht overeenkomen (n=6-8) zonder bekende factoren die het lipidenmetabolisme verstoren, zullen ook worden gerekruteerd uit de Campodimele-populatie.

Metabool protocol: de onderzoekers hebben nieuwe methoden ontwikkeld en gevalideerd die het mogelijk maken om gelijktijdig de kinetiek van TG's in grote VLDL1 en kleinere VLDL2, apoB48 in chylomicronen, VLDL1 en VLDL2, apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL en LDL, en de productie- en katabole snelheden te volgen. voor apoC-III en apoE. Proefpersonen krijgen een injectie van 500 mg gedeutereerde glycerol om de kinetiek van triglyceriden te beoordelen, en een injectie van gedeutereerde leucine (7 mg/kg lichaamsgewicht) om de kinetiek van apoB100, apoB48, apoC-III en apoE te beoordelen. Om het chylomicronmetabolisme te evalueren, krijgen proefpersonen 2 uur na injectie van isotopen een standaard vetrijke maaltijd die 927 kcal (59,5 % vet (68 g), 24,4 % koolhydraten (63 g) en 15,5 % eiwit (40 g) bevat). Gedurende 8 uur zullen op frequente tijdstippen bloedmonsters worden genomen, gevolgd door verdere bloedmonsters die de volgende ochtend (24 uur) en op dag 2, 3 en 4 na toediening van de tracer worden afgenomen. Het totale bloedvolume dat gedurende de periode van de kinetische studie moet worden afgenomen (ongeveer 350 ml) is verminderd omdat sommige proefpersonen (met name homozygoten) ouder zijn. (Dit volume aan bloeddonatie wordt als acceptabel beschouwd en is lager dan wat in eerdere klinische onderzoeken bij deze populatie is verzameld). De vermindering van het afgenomen bloed verandert niets aan ons vermogen om de volledige set kinetische parameters af te leiden. De onderzoekers zullen optimaal gebruik maken van de zeer gevoelige analytische technieken. Het klinische team van Dr. Arca zal het metabolische protocol ter plaatse uitvoeren in een speciaal klinisch pand in Campodimele. Monsters zullen naar zijn laboratorium in Rome worden gebracht voor aliquotatie en verzending. Lipoproteïne-isolatie: Isolatie van lipoproteïnefracties voor kinetische analyse is tijdrovend en vereist gespecialiseerde apparatuur (ultracentrifuges) en aanzienlijke expertise; het isoleren van TRL-fracties van proefpersonen met een lage plasma-TG is nog uitdagender. De bereiding van lipoproteïnefracties zal daarom gebeuren in het laboratorium van Dr. Taskinen in Helsinki (na verzending op ijs vanuit Rome). Chylomicrons, VLDL1, VLDL2, IDL en LDL zullen worden geïsoleerd in een beproefde stapsgewijze centrifugale procedure. Eerst wordt de totale TRL geconcentreerd door ultracentrifugatie (d <1,006 g/ml gedurende 18 uur) en vervolgens wordt deze 'top'-fractie geoogst en gebruikt om chylomicronen (Sf >400), VLDL1 (Sf 60-400) te isoleren, en VLDL2 (Sf 20-60) door dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. De fractie d>1,006 g/ml ('bodem') zal worden gebruikt om IDL en LDL te scheiden in verdere sequentiële centrifugatiestappen. Deze methoden worden routinematig toegepast in het laboratorium in Helsinki. De geïsoleerde lipoproteïnefracties worden vervolgens voorbereid voor overdracht naar Göteborg voor verrijkingsanalyses. Deze voorbereiding omvat metingen van TG, cholesterol, fosfolipiden en eiwitconcentratie, en delipidatie, precipitatie en meting van apoB. Analyses van verrijkingen van isotopen in apoproteïnen en lipiden, en wiskundige modellering: De volgende stap in het kinetisch onderzoek is de analyse van de verrijking van stabiele isotopen met behulp van zeer gevoelige massaspectrometrische methoden. De concentraties van lipiden en apolipoproteïnen (apoB100, apoB48, apoC-III en apoE) zullen worden bepaald met behulp van immunoassay- en massaspectrometrische technieken in volledig plasma en in lipoproteïnefracties op elk tijdstip in het metabole protocol. Isotopenverrijking in apoproteïnen en lipiden (triglyceriden) zal gebeuren met behulp van GC/MS. Al deze methoden, inclusief monsteroverdracht, zijn robuust en goed ingeburgerd in de laboratoria van Helsinki en Göteborg, en zijn het onderwerp geweest van een reeks publicaties. De isotopenverrijkingsresultaten en TG/apoproteïneconcentraties in alle geïsoleerde fracties vormen de dataset waarop de multicompartimentele modellering wordt uitgevoerd. De onderzoekers hebben onze modellen met succes ontwikkeld en toegepast op gegevens afkomstig van proefpersonen met een verscheidenheid aan aandoeningen (hypertriglyceridemie, hypotriglyceridemie, diabetes) en met of zonder lipidenverlagende behandeling. De modellen zijn van toepassing op alle aangetroffen omgevingen en hebben nieuwe inzichten opgeleverd in het metabolisme van lipoproteïnen.12x-14 Kinetische parameters afgeleid van modellen met meerdere compartimenten zijn: Productiesnelheden voor apoB48-deeltjes in de chylomicron-, VLDL1- en VLDL2-fracties. Productiesnelheden voor apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL en LDL. Lipolysepercentages voor TG in VLDL1 en VLDL2 Fractionele klaringspercentages voor apoB48-bevattende deeltjes in chylomicrons, VLDL1, VLDL2, en voor apoB100-bevattende deeltjes in VLDL1, VLDL2, IDL en LDL. Omzettingssnelheden van chylomicronen naar VLDL1 en VLDL2, omzettingssnelheden van VLDL1 naar VLDL2 naar IDL en naar LDL. Productie- en opruimingspercentages van apoC-III en apoE.

Belangrijkste uitkomstmaten en studieresultaten. Hoe ANGPTL3 het lipoproteïnemetabolisme bij mensen reguleert, is onbekend en daarom is het belangrijk om open te staan ​​voor het precieze werkingsmechanisme op apoB- en TG-kinetiek, zoals onderzocht in deze studie. Onze werkhypothese, gebaseerd op waarnemingen tot nu toe bij LOF-dragers, is dat het een impact heeft op alle apoB-bevattende lipoproteïnen die verschilt van andere regulerende factoren zoals die welke de lipoproteïneproductie veranderen - microsomale triglycerideoverdracht (MTP) eiwitactiviteit of mutaties die remmen VLDL1-assemblage (TM6SF2), of die de door lipoproteïnereceptor gemedieerde klaring veranderen, zoals PCSK9.

De onderzoekers hebben onlangs onderzoek gepubliceerd naar factoren die de productie van apoB en TG veranderen, zoals TM6SF2, PNPLA3 en de rol van PCSK9 bij het beheersen van het katabolisme van apoB-bevattende lipoproteïnen. Verder, en belangrijker, voltooien de onderzoekers net een kinetische studie in een groep apoCIII LOF-dragers die lage TG-niveaus en andere fenotypische eigenschappen vertonen die vergelijkbaar zijn met die in ANGPTL3 LOF (tot nu toe niet gepubliceerd). De beschikbaarheid van deze vergelijkende onderzoeken biedt een metabole achtergrond waartegen we de specifieke acties van ANGPTL3 kunnen evalueren.

De primaire evaluatie zal zich richten op de verschillen in VLDL1-, VLDL2-, IDL- en LDL-klaringspercentages, de percentages van TG-lipolyse in VLDL1 en VLDL2, en de conversiepercentages van VLDL1/VLDL2 naar IDL en LDL in de homozygote S17X-dragers in vergelijking met heterozygoten en controles. De belangrijkste onderzoeksvraag is: "Resulteert ANGPTL3-deficiëntie of -afwezigheid in verhoogde lipolyse en verhoogde fractionele klaringspercentages voor VLDL2 en IDL (de voorlopers van LDL), wat vervolgens leidt tot een verminderde intravasculaire generatie van LDL-deeltjes en mogelijk een vermindering van het circulerende niveau van overgebleven lipoproteïnen". de onderzoeker zal ook een mogelijk gendosiseffect onderzoeken door heterozygoten op te nemen in de statistische analyse. De belangrijkste kinetische parameters zullen worden getest in ANOVA-modellen, met inbegrip van mogelijke verstorende factoren zoals geslacht en BMI.

de secundaire hypothese dat ANGPTL3 werkt om de algehele opbouw en secretie van lipoproteïnen in de lever te verminderen, zal direct worden getest door de productiesnelheden van VLDL1, VLDL2, IDL en LDL apoB100 en de secretiesnelheid van VLDL1-TG en VLDL2-TG in de drie te vergelijken vakgroepen.

Verdere resultaten zullen zijn om de proteomische en lipidomische samenstellingsgegevens af te stemmen op variatie in kinetische parameters. Als het zo is dat ANGPTL3 LOF-dragers zeer lage niveaus van resterende deeltjes (en andere atherogene lipoproteïnen) hebben, dan kan de samenstelling van VLDL-fracties, IDL en LDL een 'signatuur met laag risico' onthullen die nuttig is bij het evalueren van de werkzaamheid van middelen die zijn ontworpen om de actie van ANGPTL3 te verlagen of te remmen.