Métabolisme in vivo des lipoprotéines contenant de l'apoB chez les sujets déficients en ANGPTL3

Hypothèse de travail

L'hypothèse de travail globale est que l'action physiologique normale d'ANGPTL3 est de ralentir la lipolyse et d'inhiber la clairance résiduelle par le foie. De cette manière, la protéine provoque une augmentation du flux de particules apoB transitant des VLDL vers la plage de densité des LDL, entraînant une augmentation nette de la production de LDL. Dans des études précédentes, nous avons observé que l'ampleur de la conversion des VLDL en IDL puis en LDL varie de 25 % à 75 %.2 Où et comment ANGPTL3 pourrait agir reste à découvrir. Une comparaison des taux de production de VLDL1 et VLDL2, des taux de lipolyse de ces particules et de la quantité d'apoB convertie en IDL puis en LDL chez les sujets témoins et ceux hétérozygotes et homozygotes pour les variants de perte de fonction (LOF) de l'ANGPTL3 permettra nous pour délimiter où ANGPTL3 agit, et éventuellement révéler un effet lié à la dose de gène.

Des hypothèses alternatives seront également explorées, notamment la possibilité qu'une lipolyse accélérée des chylomicrons chez les porteurs de LOF ANGPTL3 entraîne une quantité inférieure à la normale de triglycérides alimentaires délivrés au foie, ce qui altère l'assemblage et la sécrétion des VLDL. Cela impliquerait que le phénotype de l'hypobêtalipoprotéinémie est principalement dû à une anomalie de la production hépatique. Ou, comme l'ont récemment suggéré des études sur l'hypercholestérolémie familiale, qu'il y a une stimulation du catabolisme des LDL lorsque l'activité de l'ANGPTL3 est réduite.

Objectifs principaux

Les principaux objectifs sont d'étudier chez les sujets hétérozygotes et homozygotes pour les variants ANGPTL3 LOF par rapport aux témoins appariés :

• Cinétique de l'apoB48 dans les chylomicrons et leurs restes à la lumière de nos enquêtes antérieures qui ont révélé des réductions spectaculaires de la chylomicronémie post-prandiale chez les porteurs LOF homozygotes.4
• Cinétique de l'apoB100 dans les VLDL1, VLDL2, IDL et LDL. Cela révélera la base de l'hypobêtalipoprotéinémie observée dans cette condition 4-6 et clarifiera comment la perte partielle ou complète d'ANGPTL3 conduit à des niveaux inférieurs de VLDL, de reliquats et de LDL.
• Cinétique de TG dans VLDL1 et VLDL2. Cela révélera comment la lipolyse est altérée lorsque l'action d'ANGPTL3 est altérée ou absente.

Objectifs secondaires

Nos objectifs secondaires sont d'étudier :

• L'impact d'ANGPTL3 sur la cinétique des principales apolipoprotéines régulatrices apoC-III et apoE, car il a été rapporté que l'apoC-III est plus faible en concentration lorsque ANGPTL3 est réduit.
• La composition détaillée des espèces de lipoprotéines contenant de l'apoB. Nous explorerons les profils protéomiques et lipidomiques des chylomicrons, VLDL1, VLDL2, IDL et LDL dans cette cohorte unique pour mieux comprendre les signatures de composition dans cette condition spécifique à «faible risque ASCVD».

Conception expérimentale et approche Recrutement des sujets : Les sujets seront recrutés sur la base de leur statut connu pour la variante S17X LOF. Les individus sont des habitants du village de Campodimele, près de Rome, en Italie. Les enquêteurs ont établi pendant de nombreuses années un lien étroit et mutuellement apprécié avec les habitants de Camapodimele et ont publié des caractéristiques clés du phénotype lipidique présenté par les porteurs du LOF ANGPTL3, qui est une hypolipidémie combinée profonde associée à des taux plasmatiques réduits de cholestérol, TG, VLDL-TG et cholestérol, cholestérol LDL, apoB et une réponse triglycéridique post-prandiale émoussée à un repas riche en graisses test. Notre plan est de recruter les 4 homozygotes disponibles et d'identifier 6 à 8 hétérozygotes qui présentent de faibles taux plasmatiques d'ANGPTL3 (<150ng/ml) et de faibles taux de TG (<120mg/dl). Des témoins sains d'âge et de sexe appariés (n = 6-8) sans facteurs connus perturbant le métabolisme des lipides seront également recrutés dans la population de Campodimele.

Protocole métabolique : Les chercheurs ont développé et validé de nouvelles méthodes permettant de suivre simultanément la cinétique des TG dans les gros VLDL1 et les plus petits VLDL2, l'apoB48 dans les chylomicrons, les VLDL1 et VLDL2, l'apoB100 dans les VLDL1, VLDL2, IDL et LDL, ainsi que les taux de production et de catabolisme pour apoC-III et apoE. Les sujets recevront une injection de 500 mg de glycérol deutéré pour évaluer la cinétique des triglycérides et une injection de leucine deutérée (7 mg/kg de poids corporel) pour évaluer la cinétique de l'apoB100, de l'apoB48, de l'apoC-III et de l'apoE. Pour évaluer le métabolisme des chylomicrons, les sujets recevront un repas standard riche en graisses contenant 927 kcal (59,5 % de matières grasses (68 g), 24,4 % de glucides (63 g) et 15,5 % de protéines (40 g) 2 heures après l'injection d'isotopes. Des échantillons de sang seront prélevés à des moments fréquents pendant 8 heures, suivis d'autres échantillons de sang prélevés le lendemain matin (24 heures) et les jours 2, 3 et 4 après l'administration du traceur. Le volume sanguin total à prélever sur la durée de l'étude cinétique (environ 350 ml) a été réduit compte tenu du fait qu'une partie des sujets (homozygotes notamment) sont âgés. (Ce volume de don de sang est considéré comme acceptable et est inférieur à ce qui a été collecté dans des études cliniques antérieures dans cette population). La réduction du sang prélevé n'altère pas notre capacité à dériver l'ensemble complet des paramètres cinétiques - Les enquêteurs feront le meilleur usage des techniques analytiques très sensibles. L'équipe clinique du Dr Arca effectuera le protocole métabolique sur place dans des locaux cliniques spéciaux à Campodimele. Des échantillons seront acheminés vers son laboratoire à Rome pour aliquotage et expédition. Isolement des lipoprotéines : l'isolement des fractions de lipoprotéines pour l'analyse cinétique prend du temps et nécessite un équipement spécialisé (ultracentrifugeuses) et une expertise considérable ; isoler les fractions TRL de sujets à faible taux plasmatique de TG est encore plus difficile. La préparation des fractions lipoprotéiques sera donc entreprise dans le laboratoire du Dr Taskinen à Helsinki (après expédition sur glace depuis Rome). Les chylomicrons, VLDL1, VLDL2, IDL et LDL seront isolés dans une procédure centrifuge par étapes bien établie. Tout d'abord, le TRL total sera concentré par ultracentrifugation (d <1,006 g/ml pendant 18 heures), puis cette fraction « supérieure » sera récoltée et utilisée pour isoler les chylomicrons (Sf > 400), VLDL1 (Sf 60-400) et VLDL2 (Sf 20-60) par ultracentrifugation en gradient de densité. La fraction d > 1,006 g/ml (« inférieure ») sera utilisée pour séparer les IDL et les LDL dans d'autres étapes séquentielles de centrifugation. Ces méthodes sont utilisées en routine dans le laboratoire d'Helsinki. Les fractions de lipoprotéines isolées sont ensuite préparées pour être transférées à Göteborg pour des analyses d'enrichissement. Cette préparation implique des mesures de la concentration de TG, de cholestérol, de phospholipides et de protéines, ainsi que la délipidation, la précipitation et la mesure de l'apoB. Analyses des enrichissements en isotopes dans les apoprotéines et les lipides, et modélisation mathématique : La prochaine étape de l'investigation cinétique est l'analyse de l'enrichissement en isotopes stables à l'aide de méthodes de spectrométrie de masse très sensibles. Les concentrations de lipides et d'apolipoprotéines (apoB100, apoB48, apoC-III et apoE) seront déterminées à l'aide de techniques d'immunodosage et de spectrométrie de masse dans le plasma total et dans les fractions lipoprotéiques à chaque instant du protocole métabolique. L'enrichissement isotopique en apoprotéines et en lipides (triglycérides) sera réalisé par GC/MS. Toutes ces méthodes, y compris les transferts d'échantillons, sont robustes et bien établies dans les laboratoires d'Helsinki et de Göteborg, et ont fait l'objet d'une série de publications. Les résultats d'enrichissement isotopique et les concentrations en TG/apoprotéines dans toutes les fractions isolées constituent le jeu de données sur lequel la modélisation multicompartimentale est conduite. Les chercheurs ont développé et appliqué avec succès nos modèles à des données provenant de sujets atteints de diverses affections (hypertriglycéridémie, hypotriglycéridémie, diabète) ainsi que sous et hors traitement hypolipidémiant. Les modèles sont applicables à tous les contextes rencontrés et ont généré de nouvelles connaissances sur le métabolisme des lipoprotéines.12x-14 Les paramètres cinétiques issus des modèles multicompartiments sont : Taux de production de particules d'apoB48 dans les fractions chylomicrons, VLDL1 et VLDL2. Taux de production d'apoB100 dans les VLDL1, VLDL2, IDL et LDL. Taux de lipolyse pour les TG dans les VLDL1 et VLDL2 Taux de clairance fractionnaire pour les particules contenant de l'apoB48 dans les chylomicrons, VLDL1, VLDL2 et pour les particules contenant de l'apoB100 dans les VLDL1, VLDL2, IDL et LDL. Taux de conversion des chylomicrons en VLDL1 et VLDL2, taux de conversion des VLDL1 en VLDL2 en IDL et en LDL. Taux de production et de clairance de l'apoC-III et de l'apoE.

Principaux critères de jugement et produits livrables de l'étude. La façon dont ANGPTL3 régule le métabolisme des lipoprotéines chez l'homme est inconnue et, par conséquent, il est important de garder l'esprit ouvert quant à son mode d'action précis sur la cinétique de l'apoB et des TG, comme exploré dans cette étude. Notre hypothèse de travail basée sur les observations à ce jour chez les porteurs de LOF est qu'il a un impact sur toutes les lipoprotéines contenant de l'apoB qui est distinct des autres facteurs de régulation tels que ceux qui modifient la production de lipoprotéines - l'activité de la protéine microsomale de transfert des triglycérides (MTP) ou les mutations qui inhibent l'assemblage VLDL1 (TM6SF2), ou ceux qui modifient la clairance médiée par le récepteur des lipoprotéines, comme PCSK9.

Les chercheurs ont récemment publié des recherches sur les facteurs qui modifient la production d'apoB et de TG tels que TM6SF2, PNPLA3 et le rôle de PCSK9 dans le contrôle du catabolisme des lipoprotéines contenant de l'apoB. De plus, et surtout, les chercheurs viennent de terminer une étude cinétique dans un groupe de porteurs d'apoCIII LOF qui présentent de faibles niveaux de TG et d'autres traits phénotypiques comparables à ceux observés dans ANGPTL3 LOF (encore non publié). La disponibilité de ces études de comparaison fournit un arrière-plan métabolique par rapport auquel nous pouvons évaluer les actions spécifiques d'ANGPTL3.

L'évaluation principale se concentrera sur les différences dans les taux de clairance des VLDL1, VLDL2, IDL et LDL, les taux de lipolyse TG dans les VLDL1 et VLDL2, et les taux de conversion des VLDL1/VLDL2 en IDL et LDL chez les porteurs homozygotes de S17X par rapport aux hétérozygotes. et contrôles. La question clé de la recherche est "est-ce que la déficience ou l'absence d'ANGPTL3 entraîne une augmentation de la lipolyse et une augmentation des taux de clairance fractionnelle pour VLDL2 et IDL (les précurseurs de LDL), ce qui conduit ensuite à une réduction de la génération intravasculaire de particules de LDL, et éventuellement à une réduction du niveau circulant de résidu lipoprotéines". l'investigateur explorera également un effet potentiel gène-dose en incluant les hétérozygotes dans l'analyse statistique. Les paramètres cinétiques clés seront testés dans des modèles ANOVA, avec l'inclusion de facteurs de confusion potentiels tels que le sexe et l'IMC.

l'hypothèse secondaire selon laquelle ANGPTL3 agit pour réduire l'assemblage et la sécrétion globale des lipoprotéines dans le foie sera testée directement en comparant les taux de production de VLDL1, VLDL2, IDL et LDL apoB100, et le taux de sécrétion de VLDL1-TG et VLDL2-TG dans les trois groupes de matières.

D'autres résultats seront d'aligner les données de composition protéomique et lipidomique avec la variation des paramètres cinétiques. S'il est vrai que les porteurs ANGPTL3 LOF ont de très faibles niveaux de particules résiduelles (et d'autres lipoprotéines athérogènes), la composition des fractions VLDL, IDL et LDL peut révéler une « signature à faible risque » qui est utile lors de l'évaluation de l'efficacité des agents conçus pour abaisser ou inhiber l'action ANGPTL3.