In vivo metabolisme af apoB-holdige lipoproteiner hos ANGPTL3-mangelfulde forsøgspersoner

Arbejdshypotese

Den overordnede arbejdshypotese er, at den normale fysiologiske virkning af ANGPTL3 er at bremse lipolyse og hæmme restclearance fra leveren. På denne måde forårsager proteinet en stigning i strømmen af ​​apoB-partikler, der passerer fra VLDL til LDL-densitetsområde, hvilket resulterer i en nettostigning i LDL-produktion. I tidligere undersøgelser har vi observeret, at omfanget af konvertering af VLDL til IDL og derefter LDL varierer fra 25% til 75%.2 Hvor og hvordan ANGPTL3 kan handle, mangler at blive opdaget. En sammenligning af hastighederne for VLDL1- og VLDL2-produktion, hastigheder for lipolyse af disse partikler og mængden af ​​apoB omdannet til IDL og derefter LDL i kontrolpersoner og de heterozygote og homozygote for ANGPTL3-funktionstabsvarianter (LOF) vil muliggøre os at afgrænse, hvor ANGPTL3 virker, og muligvis afsløre en gen-dosis-relateret effekt.

Alternative hypoteser vil også blive undersøgt, herunder muligheden for, at accelereret chylomikron lipolyse i ANGPTL3 LOF-bærere fører til, at en subnormal mængde af diættriglycerider afgives til leveren, hvilket som et resultat hæmmer VLDL-samling og sekretion. Dette ville betyde, at hypobetalipoproteinæmi-fænotypen primært skyldes en abnormitet i leverproduktionen. Eller, som for nylig antydet fra undersøgelser af familiær hyperkolesterolæmi, at der er en stimulering af LDL-katabolisme, når ANGPTL3-aktiviteten reduceres.

Primære mål

De primære mål er at undersøge hos forsøgspersoner, der er heterozygote og homozygote for ANGPTL3 LOF-varianter sammenlignet med matchede kontroller:

• Kinetik af apoB48 i chylomikroner og deres rester i lyset af vores tidligere undersøgelser, der afslørede dramatiske reduktioner i post-prandial chylomicronaemia hos homozygote LOF-bærere.4
• Kinetik af apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL og LDL. Dette vil afsløre grundlaget for hypobetalipoproteinæmien set i denne tilstand 4-6 og afklare, hvordan delvist eller fuldstændigt tab af ANGPTL3 fører til lavere niveauer af VLDL, rester og LDL.
• Kinetik af TG i VLDL1 og VLDL2. Dette vil afsløre, hvordan lipolyse ændres, når ANGPTL3-virkningen er svækket eller fraværende.

Sekundære mål

Vores sekundære mål er at undersøge:

• Virkningen af ​​ANGPTL3 på kinetikken af ​​de centrale regulatoriske apolipoproteiner apoC-III og apoE, da apoC-III er blevet rapporteret at være lavere i koncentration, når ANGPTL3 reduceres.
• Den detaljerede sammensætning af apoB-holdige lipoproteinarter. Vi vil udforske de proteomiske og lipidomiske profiler af chylomikroner, VLDL1, VLDL2, IDL og LDL i denne unikke kohorte for yderligere at forstå de sammensætningsmæssige signaturer i denne specifikke 'lav ASCVD-risiko' tilstand.

Eksperimentelt design og tilgang Emner rekruttering: Emner vil blive rekrutteret på grundlag af deres kendte status for S17X LOF varianten. Personerne er indbyggere i landsbyen Campodimele, nær Rom, Italien. Efterforskerne har gennem mange år etableret en tæt og gensidigt værdsat forbindelse med befolkningen i Camapodimele og har offentliggjort nøglekarakteristika for lipidfænotypen, der udvises af dem, der bærer ANGPTL3 LOF, som er en dyb kombineret hypolipidæmi forbundet med reducerede plasmaniveauer af total kolesterol, TG, VLDL-TG og kolesterol, LDL-kolesterol, apoB, og en afstumpet post-prandial triglycerid-respons på et fedt-testmåltid. Vores plan er at rekruttere de 4 tilgængelige homozygoter og identificere 6-8 heterozygoter, der udviser lave ANGPTL3 plasmaniveauer (<150ng/ml) og lavt TG (<120mg/dl). Alders- og kønsvarende sunde kontroller (n=6-8) uden kendte faktorer, der forstyrrer lipidmetabolismen, vil også blive rekrutteret fra Campodimele-populationen.

Metabolisk protokol: Efterforskerne har udviklet og valideret nye metoder, der gør det muligt på samme tid at følge kinetikken af ​​TG'er i store VLDL1 og mindre VLDL2, apoB48 i chylomikroner, VLDL1 og VLDL2, apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL'er og katabolisk produktion og LDL, for apoC-III og apoE. Forsøgspersonerne vil modtage en 500 mg injektion af deutereret glycerol for at vurdere triglyceridkinetikken og en injektion af deutereret leucin (7 mg/kg kropsvægt) for at vurdere kinetikken af ​​apoB100, apoB48, apoC-III og apoE. For at evaluere chylomikronmetabolismen vil forsøgspersonerne få serveret et standard fedtrigt måltid, der indeholder 927 kcal (59,5 % fedt (68 g), 24,4 % kulhydrat (63 g) og 15,5 % protein (40 g) 2 timer efter injektion af isotoper. Blodprøver vil blive taget på hyppige tidspunkter i 8 timer efterfulgt af yderligere blodprøver taget næste morgen (24 timer) og på dag 2, 3 og 4 efter indgivelse af sporstof. Den samlede blodvolumen, der skal udtages i løbet af den kinetiske undersøgelse (ca. 350 ml) er blevet reduceret i erkendelse af, at nogle af forsøgspersonerne (især homozygoter) er ældre. (Denne mængde bloddonation anses for acceptabel og er under det, der er blevet indsamlet i tidligere kliniske undersøgelser i denne population). Reduktionen i blodudtaget ændrer ikke vores evne til at udlede det fulde sæt af kinetiske parametre - Efterforskerne vil gøre bedst brug af de meget følsomme analyseteknikker. Dr. Arcas kliniske team vil udføre den metaboliske protokol på stedet i særlige kliniske lokaler i Campodimele. Prøver vil blive taget til hans laboratorium i Rom til alikvotering og forsendelse. Lipoproteinisolering: Isolering af lipoproteinfraktioner til kinetisk analyse er tidskrævende og kræver specialiseret udstyr (ultracentrifuger) og betydelig ekspertise; isolering af TRL-fraktioner fra forsøgspersoner med lav plasma-TG er endnu mere udfordrende. Forberedelse af lipoproteinfraktioner vil derfor blive foretaget i Dr. Taskinens laboratorium i Helsinki (efter forsendelse på is fra Rom). Chylomikroner, VLDL1, VLDL2, IDL og LDL vil blive isoleret i en veletableret trinvis centrifugalprocedure. Først vil total TRL blive koncentreret ved ultracentrifugering (d <1,006 g/ml i 18 timer), og derefter vil denne 'top' fraktion blive høstet og brugt til at isolere chylomikroner (Sf >400), VLDL1 (Sf 60-400) og VLDL2 (Sf 20-60) ved densitetsgradient ultracentrifugering. Fraktionen d>1,006 g/ml ('bund') vil blive brugt til at adskille IDL og LDL i yderligere sekventielle centrifugeringstrin. Disse metoder anvendes rutinemæssigt i Helsinki-laboratoriet. De isolerede lipoproteinfraktioner forberedes derefter til overførsel til Gøteborg for berigelsesanalyser. Dette præparat involverer målinger af TG, kolesterol, fosfolipider og proteinkoncentration, og delipidering, udfældning og måling af apoB. Analyser af berigelser af isotoper i apoproteiner og lipider og matematisk modellering: Næste trin i den kinetiske undersøgelse er analysen af ​​berigelsen af ​​stabile isotoper ved hjælp af meget følsomme massespektrometrimetoder. Koncentrationerne af lipider og apolipoproteiner (apoB100, apoB48, apoC-III og apoE) vil blive bestemt ved hjælp af immunoassay- og massespektrometriteknikker i helplasma og i lipoproteinfraktioner på hvert tidspunkt i den metaboliske protokol. Isotopberigelse i apoproteiner og lipider (triglycerider) vil blive udført ved hjælp af GC/MS. Alle disse metoder, inklusive prøveoverførsler, er robuste og veletablerede i Helsinki- og Gøteborg-laboratorierne og har været genstand for en række publikationer. Isotopberigelsesresultaterne og TG/apoprotein-koncentrationer i alle de isolerede fraktioner udgør det datasæt, som den multikompartmentelle modellering udføres på. Efterforskerne har med succes udviklet og anvendt vores modeller på data afledt af forsøgspersoner med en række forskellige tilstande (hypertriglyceridæmi, hypotriglyceridæmi, diabetes) såvel som til og fra lipidsænkende behandling. Modellerne er anvendelige til alle indstillinger og har genereret ny indsigt i lipoproteinmetabolisme.12x-14 Kinetiske parametre afledt af multikompartmentelle modeller er: Produktionshastigheder for apoB48-partikler i chylomikron-, VLDL1- og VLDL2-fraktionerne. Produktionshastigheder for apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL og LDL. Lipolysehastigheder for TG i VLDL1 og VLDL2 Fraktionelle clearancehastigheder for apoB48-holdige partikler i chylomikroner, VLDL1, VLDL2 og for apoB100-holdige partikler i VLDL1, VLDL2, IDL og LDL. Omdannelseshastigheder af chylomikroner til VLDL1 og VLDL2, omdannelseshastigheder af VLDL1 til VLDL2 til IDL og til LDL. Produktions- og clearancehastigheder for apoC-III og apoE.

Hovedresultatmål og undersøgelsesresultater. Hvordan ANGPTL3 regulerer lipoproteinmetabolisme hos mennesker er ukendt, og derfor er det vigtigt at holde et åbent sind med hensyn til dets præcise virkemåde på apoB- og TG-kinetik som udforsket i denne undersøgelse. Vores arbejdshypotese baseret på observationer til dato i LOF-bærere er, at det har en indvirkning på alle apoB-holdige lipoproteiner, der adskiller sig fra andre regulatoriske faktorer såsom dem, der ændrer lipoproteinproduktion - mikrosomal triglyceridoverførsel (MTP) proteinaktivitet eller mutationer, der hæmmer VLDL1-samling (TM6SF2), eller dem, der ændrer lipoprotein-receptor-medieret clearance, såsom PCSK9.

Efterforskerne har for nylig offentliggjort forskning af faktorer, der ændrer apoB- og TG-produktion, såsom TM6SF2, PNPLA3 og PCSK9's rolle i at kontrollere katabolismen af ​​apoB-holdige lipoproteiner. Yderligere, og hvad der er vigtigt, er efterforskerne netop ved at afslutte en kinetisk undersøgelse i en gruppe af apoCIII LOF-bærere, som udviser lave TG-niveauer og andre fænotypiske træk, der kan sammenlignes med dem, der ses i ANGPTL3 LOF (endnu ikke offentliggjort). Tilgængeligheden af ​​disse komparatorundersøgelser giver en metabolisk baggrund, som vi kan evaluere de specifikke handlinger af ANGPTL3.

Den primære evaluering vil fokusere på forskellene i VLDL1-, VLDL2-, IDL- og LDL-clearance-rater, hastighederne for TG-lipolyse i VLDL1 og VLDL2 og hastighederne for konvertering af VLDL1/VLDL2 til IDL og LDL i de homozygote S17X-bærere sammenlignet med heterozygoter og kontroller. Det centrale forskningsspørgsmål er "resultater ANGPTL3-mangel eller -fravær i øget lipolyse og øgede fraktionerede clearance-rater for VLDL2 og IDL (forstadierne til LDL), som derefter fører til reduceret intravaskulær dannelse af LDL-partikler og muligvis reduktion i det cirkulerende niveau af rester lipoproteiner". undersøgeren vil også undersøge en potentiel gen-dosis effekt ved at inkludere heterozygoter i den statistiske analyse. De vigtigste kinetiske parametre vil blive testet i ANOVA-modeller, med inklusion af potentielle forstyrrende faktorer såsom køn og BMI.

den sekundære hypotese, at ANGPTL3 virker til at reducere den samlede lipoproteinsamling og sekretion i leveren, vil blive testet direkte ved at sammenligne produktionshastighederne for VLDL1, VLDL2, IDL og LDL apoB100 og sekretionshastigheden af ​​VLDL1-TG og VLDL2-TG i de tre faggrupper.

Yderligere resultater vil være at tilpasse de proteomiske og lipidomiske sammensætningsdata med variation i kinetiske parametre. Hvis det er tilfældet, at ANGPTL3 LOF-bærere har meget lave niveauer af resterende partikler (og andre atherogene lipoproteiner), så kan sammensætningen af ​​VLDL-fraktioner, IDL og LDL afsløre en 'lavrisikosignatur', som er nyttig ved evaluering af effektiviteten af ​​midler designet for at sænke eller hæmme ANGPTL3-virkningen.