ANGPTL3 결핍 피험자에서 apoB 함유 지단백질의 생체 내 대사

작업 가설

전반적인 작동 가설은 ANGPTL3의 정상적인 생리학적 작용이 지방 분해를 늦추고 간에 의한 잔여 제거를 억제하는 것이라는 것입니다. 이러한 방식으로 단백질은 VLDL에서 LDL 밀도 범위로 이동하는 apoB 입자의 플럭스를 증가시켜 LDL 생산의 순 증가를 초래합니다. 이전 연구에서 우리는 VLDL에서 IDL로 전환된 다음 LDL로 전환되는 정도가 25%에서 75%까지 다양하다는 것을 관찰했습니다.2 ANGPTL3이 어디에서 어떻게 작용할지는 아직 밝혀지지 않았습니다. VLDL1 및 VLDL2 생성 속도, 이들 입자의 지방분해 속도, 대조군 대상체 및 ANGPTL3 기능 상실(LOF) 변이체에 대한 이형접합체 및 동형접합체에서 IDL 및 LDL로 전환된 apoB의 양의 비교는 가능하게 할 것이다. ANGPTL3이 작용하는 위치를 설명하고 유전자 용량 관련 효과를 밝힐 수 있습니다.

ANGPTL3 LOF 운반체에서 가속화된 킬로미크론 지방분해가 정상 이하의 양의 식이성 트리글리세리드를 간으로 전달하여 결과적으로 VLDL 조립 및 분비를 손상시킬 가능성을 포함하는 다른 가설도 탐색될 것입니다. 이것은 저베타지방단백혈증 표현형이 주로 간 생산의 이상으로 인한 것임을 의미합니다. 또는 최근에 가족성 고콜레스테롤혈증에 대한 연구에서 제안된 바와 같이 ANGPTL3 활성이 감소하면 LDL 이화 작용이 자극됩니다.

주요 목표

1차 목표는 일치하는 대조군과 비교하여 ANGPTL3 LOF 변이체에 대해 이형접합 및 동형접합 대상체에서 다음을 조사하는 것입니다.

• 동형접합체 LOF 보인자에서 식후 유미미소혈증의 극적인 감소를 밝힌 우리의 초기 조사에 비추어 유미미립자 및 그 잔해에서 apoB48의 동역학.4
• VLDL1, VLDL2, IDL 및 LDL에서 apoB100의 동역학. 이것은 이 조건 4-6에서 보이는 저베타지방단백혈증의 근거를 밝히고 ANGPTL3의 부분적 또는 완전한 손실이 VLDL, 잔여물 및 LDL의 낮은 수준으로 이어지는 방법을 명확히 할 것입니다.
• VLDL1 및 VLDL2에서 TG의 동역학. 이것은 ANGPTL3 작용이 손상되거나 부재할 때 지방 분해가 어떻게 변경되는지를 밝힐 것입니다.

보조 목표

두 번째 목표는 다음을 조사하는 것입니다.

• 주요 규제 아포지단백질인 apoC-III 및 apoE의 동역학에 대한 ANGPTL3의 영향은 ANGPTL3이 감소될 때 apoC-III의 농도가 낮아지는 것으로 보고되었기 때문입니다.
• apoB 함유 지단백질 종의 상세한 구성. 우리는 이 독특한 코호트에서 킬로미크론, VLDL1, VLDL2, IDL 및 LDL의 프로테오믹 및 리피도믹 프로파일을 탐색하여 이 특정 '낮은 ASCVD 위험' 조건에서 구성 시그니처를 더 자세히 이해할 것입니다.

실험 설계 및 접근 피험자 모집: 피험자는 S17X LOF 변형에 대해 알려진 상태에 따라 모집됩니다. 개인은 이탈리아 로마 근처의 Campodimele 마을 주민입니다. 연구자들은 수년에 걸쳐 Camapodimele 사람들과 긴밀하고 상호 가치 있는 관계를 확립했으며 ANGPTL3 LOF를 가진 사람들이 나타내는 지질 표현형의 주요 특징을 발표했습니다. 콜레스테롤, TG, VLDL-TG 및 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, apoB 및 테스트 지방 식사에 대한 무딘 식후 트리글리세라이드 반응. 우리의 계획은 이용 가능한 4개의 동형접합체를 모집하고 낮은 ANGPTL3 혈장 수치(<150ng/ml) 및 낮은 TG(<120mg/dl)를 나타내는 6-8개의 이형접합체를 식별하는 것입니다. 지질 대사를 교란시키는 알려진 요인이 없는 연령 및 성별에 맞는 건강한 대조군(n=6-8)도 Campodimele 집단에서 모집할 것입니다.

대사 프로토콜: 연구자들은 큰 VLDL1 및 작은 VLDL2, 킬로미크론의 apoB48, VLDL1 및 VLDL2, VLDL1, VLDL2, IDL 및 LDL의 apoB100에서 TG의 역학을 동시에 추적할 수 있는 새로운 방법을 개발하고 검증했습니다. apoC-III 및 apoE용. 피험자는 트리글리세리드 동역학을 평가하기 위해 중수소화 글리세롤 500mg 주사를 받고 apoB100, apoB48, apoC-III 및 apoE의 동역학을 평가하기 위해 중수소화 류신(7mg/kg 체중)을 주사합니다. 킬로미크론 대사를 평가하기 위해 대상체는 동위원소 주입 2시간 후 927kcal(59.5% 지방(68g), 24.4% 탄수화물(63g) 및 15.5% 단백질(40g)을 포함하는 표준 지방이 풍부한 식사를 제공받게 됩니다. 혈액 샘플은 8시간 동안 빈번한 시점에서 채취한 다음 다음날 아침(24시간) 및 추적자 투여 후 2일, 3일 및 4일에 추가 혈액 샘플을 채취합니다. 동역학 연구 기간 동안 회수할 총 혈액량(약 350ml)은 일부 피험자(특히 동형접합체)가 노인이라는 인식으로 감소되었습니다. (이 헌혈 양은 허용 가능한 것으로 간주되며 이 집단에 대한 이전 임상 연구에서 수집된 것보다 낮습니다). 채혈의 감소는 운동 매개변수의 전체 세트를 도출하는 우리의 능력을 변경하지 않습니다. 조사자는 매우 민감한 분석 기술을 최대한 활용할 것입니다. Arca 박사의 임상 팀은 Campodimele의 특수 임상 구내에서 현장에서 대사 프로토콜을 수행할 것입니다. 샘플은 분주 및 배송을 위해 로마에 있는 그의 실험실로 가져갈 것입니다. 지단백질 분리: 동역학 분석을 위한 지단백질 분획의 분리는 시간이 많이 걸리고 특수 장비(초고속 원심 분리기)와 상당한 전문 지식이 필요합니다. 혈장 TG가 낮은 피험자로부터 TRL 분획을 분리하는 것은 훨씬 더 어렵습니다. 따라서 지단백질 분획의 준비는 헬싱키에 있는 Dr Taskinen의 실험실에서 수행됩니다(로마에서 얼음으로 배송된 후). 킬로미크론, VLDL1, VLDL2, IDL 및 LDL은 잘 확립된 단계적 원심분리 절차로 분리됩니다. 먼저 총 TRL은 초원심분리(18시간 동안 d <1.006 g/ml)로 농축한 다음 이 '상단' 분획을 수확하여 킬로미크론(Sf >400), VLDL1(Sf 60-400) 및 밀도 구배 초원심분리에 의한 VLDL2(Sf 20-60). d>1.006g/ml('바닥') 분획은 추가 순차적 원심분리 단계에서 IDL과 LDL을 분리하는 데 사용됩니다. 이러한 방법은 헬싱키 연구소에서 일상적으로 사용됩니다. 분리된 지단백질 분획은 농축 분석을 위해 예테보리로 옮길 준비를 합니다. 이 준비에는 TG, 콜레스테롤, 인지질 및 단백질 농도의 측정과 apoB의 탈지, 침전 및 측정이 포함됩니다. 아포단백질 및 지질의 동위원소 농축 분석 및 수학적 모델링: 동역학 조사의 다음 단계는 고감도 질량 분석법을 사용하여 안정 동위원소 농축 분석입니다. 지질 및 아포지단백질(apoB100, apoB48, apoC-III 및 apoE)의 농도는 대사 프로토콜의 각 시점에서 전체 혈장 및 지단백질 분획에서 면역분석 및 질량 분석 기술을 사용하여 결정됩니다. 아포단백질 및 지질(트리글리세리드)의 동위원소 농축은 GC/MS를 사용하여 수행됩니다. 샘플 전송을 포함한 이러한 모든 방법은 견고하고 헬싱키 및 예테보리 실험실에서 잘 확립되었으며 일련의 간행물의 주제가 되었습니다. 모든 분리된 분획의 동위원소 농축 결과 및 TG/아포단백질 농도는 다중 구획 모델링이 수행되는 데이터 세트를 형성합니다. 연구자들은 다양한 조건(고중성지방혈증, 저중성지방혈증, 당뇨병) 및 온/오프 지질 저하 치료를 가진 피험자로부터 파생된 데이터에 모델을 성공적으로 개발하고 적용했습니다. 이 모델은 발생하는 모든 설정에 적용 가능하며 지단백질 대사에 대한 새로운 통찰력을 생성했습니다.12x-14 다구획 모델에서 파생된 동역학 매개변수는 다음과 같습니다. 킬로미크론, VLDL1 및 VLDL2 분획에서 apoB48 입자의 생산 속도. VLDL1, VLDL2, IDL 및 LDL에서 apoB100의 생산 속도. VLDL1 및 VLDL2에서 TG에 대한 지방분해율 킬로미크론, VLDL1, VLDL2에서 apoB48 함유 입자 및 VLDL1, VLDL2, IDL 및 LDL에서 apoB100 함유 입자에 대한 부분 제거율. 킬로미크론의 VLDL1 및 VLDL2로의 전환율, VLDL1에서 VLDL2로, IDL 및 LDL로의 전환율. apoC-III 및 apoE의 생성 및 제거율.

주요 결과 측정 및 연구 결과물. ANGPTL3이 인간의 지단백질 대사를 조절하는 방법은 알려져 있지 않으므로 이 연구에서 탐구한 apoB 및 TG 동역학에 대한 정확한 작용 방식에 대해 열린 마음을 유지하는 것이 중요합니다. 현재까지 LOF 보균자에 대한 관찰에 기초한 우리의 작업 가설은 그것이 지단백질 생산을 변경하는 것과 같은 다른 조절 요인과 구별되는 모든 apoB 함유 지단백질에 영향을 미친다는 것입니다 - 마이크로솜 트리글리세라이드 전달(MTP) 단백질 활동 또는 억제하는 돌연변이 VLDL1 어셈블리(TM6SF2), 또는 PCSK9와 같은 지단백질 수용체 매개 클리어런스를 변경하는 어셈블리.

연구자들은 최근에 TM6SF2, PNPLA3와 같은 apoB 및 TG 생산을 변경하는 요인과 apoB 함유 지단백질의 이화작용을 조절하는 PCSK9의 역할에 대한 연구를 발표했습니다. 더 나아가 중요한 것은 조사자들이 ANGPTL3 LOF(아직 발표되지 않음)에서 볼 수 있는 것과 유사한 낮은 TG 수준 및 기타 표현형 특성을 나타내는 apoCIII LOF 운반체 그룹에서 동역학 연구를 막 완료하고 있다는 것입니다. 이러한 비교 연구의 가용성은 ANGPTL3의 특정 작업을 평가할 수 있는 대사 배경을 제공합니다.

1차 평가는 VLDL1, VLDL2, IDL 및 LDL 청소율의 차이, VLDL1 및 VLDL2에서 TG 지방 분해율, VLDL1/VLDL2에서 동형접합 S17X 운반체의 IDL 및 LDL로의 전환율에 초점을 맞출 것입니다. 및 컨트롤. 주요 연구 질문은 "ANGPTL3 결핍 또는 부재가 지방 분해를 증가시키고 VLDL2 및 IDL(LDL의 전구체)에 대한 부분 청소율을 증가시켜 LDL 입자의 혈관 내 생성을 감소시키고 잔여 물질의 순환 수준을 감소시킬 수 있는지 여부입니다. 지단백질". 조사자는 또한 통계 분석에 이형접합체를 포함시켜 잠재적인 유전자 용량 효과를 탐색할 것입니다. 주요 운동 매개변수는 성별 및 BMI와 같은 잠재적인 교란 요인을 포함하여 ANOVA 모델에서 테스트됩니다.

ANGPTL3이 간에서 전체 지단백질 조립 및 분비를 감소시키는 역할을 한다는 2차 가설은 VLDL1, VLDL2, IDL 및 LDL apoB100의 생산 속도와 VLDL1-TG 및 VLDL2-TG의 분비 속도를 비교하여 직접 테스트할 것입니다. 주제 그룹.

추가 결과는 동역학 매개변수의 변화에 ​​따라 프로테오믹 및 리피도믹 구성 데이터를 정렬하는 것입니다. ANGPTL3 LOF 캐리어가 매우 낮은 수준의 잔여 입자(및 기타 죽상경화성 지단백질)를 갖는 경우 VLDL 분획, IDL 및 LDL의 구성은 설계된 제제의 효능을 평가할 때 도움이 되는 '저위험 시그니처'를 나타낼 수 있습니다. ANGPTL3 작용을 낮추거나 억제합니다.