Metabolismo in vivo delle lipoproteine ​​contenenti apoB in soggetti con deficit di ANGPTL3

Ipotesi di lavoro

L'ipotesi di lavoro complessiva è che la normale azione fisiologica di ANGPTL3 sia quella di rallentare la lipolisi e inibire la clearance residua da parte del fegato. In questo modo, la proteina provoca un aumento del flusso di particelle di apoB che transitano dalle VLDL all'intervallo di densità delle LDL, determinando un netto aumento della produzione di LDL. In studi precedenti abbiamo osservato che il grado di conversione delle VLDL in IDL e quindi in LDL varia dal 25% al ​​75%.2 Resta da scoprire dove e come potrebbe agire ANGPTL3. Un confronto tra i tassi di produzione di VLDL1 e VLDL2, i tassi di lipolisi di queste particelle e la quantità di apoB convertita in IDL e quindi in LDL nei soggetti di controllo e quelli eterozigoti e omozigoti per le varianti con perdita di funzione ANGPTL3 (LOF) consentirà noi per delineare dove agisce ANGPTL3 e possibilmente rivelare un effetto correlato alla dose genica.

Verranno anche esplorate ipotesi alternative, inclusa la possibilità che la lipolisi accelerata dei chilomicroni nei portatori di ANGPTL3 LOF porti a una quantità subnormale di trigliceridi alimentari che viene consegnata al fegato che di conseguenza compromette l'assemblaggio e la secrezione di VLDL. Ciò implicherebbe che il fenotipo dell'ipobetalipoproteinemia è principalmente dovuto a un'anomalia nella produzione epatica. Oppure, come recentemente suggerito da studi sull'ipercolesterolemia familiare, che c'è una stimolazione del catabolismo delle LDL quando l'attività di ANGPTL3 è ridotta.

Obiettivi primari

Gli obiettivi primari sono di indagare nei soggetti eterozigoti e omozigoti per le varianti LOF ANGPTL3 rispetto ai controlli appaiati:

• Cinetica dell'apoB48 nei chilomicroni e nei loro resti alla luce delle nostre precedenti indagini che hanno rivelato drastiche riduzioni della chilomicronemia post-prandiale nei portatori omozigoti di LOF.4
• Cinetica di apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL e LDL. Ciò rivelerà la base dell'ipobetalipoproteinemia osservata in questa condizione 4-6 e chiarirà come la perdita parziale o completa di ANGPTL3 porti a livelli più bassi di VLDL, residui e LDL.
• Cinetica di TG in VLDL1 e VLDL2. Questo rivelerà come la lipolisi viene alterata quando l'azione di ANGPTL3 è compromessa o assente.

Obiettivi secondari

I nostri obiettivi secondari sono di indagare:

• L'impatto di ANGPTL3 sulla cinetica delle principali apolipoproteine ​​regolatorie apoC-III e apoE, poiché è stato riportato che apoC-III ha una concentrazione inferiore quando ANGPTL3 è ridotto.
• La composizione dettagliata delle specie di lipoproteine ​​​​contenenti apoB. Esploreremo i profili proteomici e lipidomici di chilomicroni, VLDL1, VLDL2, IDL e LDL in questa coorte unica per comprendere ulteriormente le firme compositive in questa specifica condizione di "basso rischio ASCVD".

Disegno sperimentale e approccio Reclutamento dei soggetti: i soggetti verranno reclutati sulla base del loro stato noto per la variante S17X LOF. Gli individui sono abitanti del villaggio di Campodimele, vicino a Roma, Italia. I ricercatori hanno stabilito nel corso di molti anni una connessione stretta e reciprocamente apprezzata con la gente di Camapodimele e hanno pubblicato caratteristiche chiave del fenotipo lipidico esibito da coloro che portano il LOF ANGPTL3, che è una profonda ipolipidemia combinata associata a livelli plasmatici ridotti di totale colesterolo, TG, VLDL-TG e colesterolo, colesterolo LDL, apoB e una ridotta risposta post-prandiale dei trigliceridi a un pasto grasso di prova. Il nostro piano è reclutare i 4 omozigoti disponibili e identificare 6-8 eterozigoti che presentano bassi livelli plasmatici di ANGPTL3 (<150 ng/ml) e bassi TG (<120 mg/dl). Dalla popolazione di Campodimele verranno reclutati anche controlli sani corrispondenti per età e sesso (n=6-8) senza fattori noti che perturbano il metabolismo lipidico.

Protocollo metabolico: i ricercatori hanno sviluppato e convalidato nuovi metodi che consentono di seguire simultaneamente la cinetica dei TG in VLDL1 grande e VLDL2 più piccolo, apoB48 in chilomicroni, VLDL1 e VLDL2, apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL e LDL e la produzione e i tassi catabolici per apoC-III e apoE. I soggetti riceveranno un'iniezione di 500 mg di glicerolo deuterato per valutare la cinetica dei trigliceridi e un'iniezione di leucina deuterata (7 mg/kg di peso corporeo) per valutare la cinetica di apoB100, apoB48, apoC-III e apoE. Per valutare il metabolismo dei chilomicroni, ai soggetti verrà servito un pasto standard ricco di grassi che contiene 927 kcal (59,5% di grassi (68 g), 24,4% di carboidrati (63 g) e 15,5% di proteine ​​(40 g) 2 ore dopo l'iniezione di isotopi. Verranno prelevati campioni di sangue a orari frequenti per 8 ore seguiti da ulteriori campioni di sangue raccolti la mattina successiva (24 ore) e nei giorni 2, 3 e 4 dopo la somministrazione del tracciante. Il volume totale di sangue da prelevare durante il periodo dello studio cinetico (circa 350 ml) è stato ridotto in considerazione del fatto che alcuni dei soggetti (omozigoti in particolare) sono anziani. (Questo volume di donazioni di sangue è considerato accettabile ed è inferiore a quanto raccolto in precedenti studi clinici in questa popolazione). La riduzione del sangue prelevato non altera la nostra capacità di derivare l'intera serie di parametri cinetici - Gli investigatori faranno il miglior uso delle tecniche analitiche altamente sensibili. L'équipe clinica del Dott. Arca eseguirà il protocollo metabolico in loco presso appositi locali a Campodimele. I campioni verranno portati al suo laboratorio di Roma per l'aliquotazione e la spedizione. Isolamento delle lipoproteine: l'isolamento delle frazioni lipoproteiche per l'analisi cinetica richiede tempo e richiede attrezzature specializzate (ultracentrifughe) e notevole esperienza; isolare le frazioni TRL da soggetti con bassi livelli di TG plasmatico è ancora più impegnativo. La preparazione delle frazioni lipoproteiche sarà quindi intrapresa nel laboratorio del Dr Taskinen a Helsinki (dopo la spedizione su ghiaccio da Roma). I chilomicroni, VLDL1, VLDL2, IDL e LDL saranno isolati mediante una consolidata procedura di centrifugazione graduale. In primo luogo, il TRL totale sarà concentrato mediante ultracentrifugazione (d <1.006 g/ml per 18 ore) e quindi questa frazione "superiore" sarà raccolta e utilizzata per isolare i chilomicroni (Sf >400), VLDL1 (Sf 60-400) e VLDL2 (Sf 20-60) mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità. La frazione d>1.006 g/ml ('bottom') verrà utilizzata per separare IDL e LDL in ulteriori passaggi sequenziali di centrifugazione. Questi metodi sono impiegati abitualmente nel laboratorio di Helsinki. Le frazioni lipoproteiche isolate vengono quindi preparate per il trasferimento a Göteborg per le analisi di arricchimento. Questa preparazione comporta misurazioni di TG, colesterolo, fosfolipidi e concentrazione proteica e delipidazione, precipitazione e misurazione di apoB. Analisi degli arricchimenti di isotopi in apoproteine ​​e lipidi e modellazione matematica: il passo successivo nell'indagine cinetica è l'analisi dell'arricchimento di isotopi stabili utilizzando metodi di spettrometria di massa altamente sensibili. Le concentrazioni di lipidi e apolipoproteine ​​(apoB100, apoB48, apoC-III e apoE) saranno determinate utilizzando tecniche di immunodosaggio e spettrometria di massa nel plasma intero e nelle frazioni lipoproteiche ad ogni punto temporale del protocollo metabolico. L'arricchimento isotopico in apoproteine ​​e lipidi (trigliceridi) sarà eseguito mediante GC/MS. Tutti questi metodi, inclusi i trasferimenti di campioni, sono solidi e ben consolidati nei laboratori di Helsinki e Göteborg e sono stati oggetto di una serie di pubblicazioni. I risultati dell'arricchimento isotopico e le concentrazioni di TG/apoproteine ​​in tutte le frazioni isolate costituiscono il set di dati su cui viene condotta la modellazione multicompartimentale. I ricercatori hanno sviluppato e applicato con successo i nostri modelli a dati derivati ​​da soggetti con una varietà di condizioni (ipertrigliceridemia, ipotrigliceridemia, diabete), nonché con e senza trattamento ipolipemizzante. I modelli sono applicabili a tutte le impostazioni incontrate e hanno generato nuove intuizioni sul metabolismo delle lipoproteine.12x-14 I parametri cinetici derivati ​​dai modelli multicompartimentali sono: Velocità di produzione delle particelle di apoB48 nelle frazioni chilomicrone, VLDL1 e VLDL2. Tassi di produzione per apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL e LDL. Tassi di lipolisi per TG in VLDL1 e VLDL2 Tassi di clearance frazionari per particelle contenenti apoB48 in chilomicroni, VLDL1, VLDL2 e per particelle contenenti apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL e LDL. Tassi di conversione dei chilomicroni in VLDL1 e VLDL2, tassi di conversione di VLDL1 in VLDL2 in IDL e in LDL. Tassi di produzione e eliminazione di apoC-III e apoE.

Principali misure di esito e risultati dello studio. Non è noto come ANGPTL3 regoli il metabolismo delle lipoproteine ​​nell'uomo e, pertanto, è importante mantenere una mente aperta sulla sua precisa modalità di azione sulla cinetica di apoB e TG, come esplorato in questo studio. La nostra ipotesi di lavoro basata sulle osservazioni fino ad oggi nei portatori di LOF è che ha un impatto su tutte le lipoproteine ​​contenenti apoB che è distinto da altri fattori regolatori come quelli che alterano la produzione di lipoproteine ​​- attività della proteina di trasferimento microsomiale dei trigliceridi (MTP) o mutazioni che inibiscono Assemblaggio VLDL1 (TM6SF2) o quelli che alterano la clearance mediata dal recettore delle lipoproteine ​​come PCSK9.

I ricercatori hanno recentemente pubblicato una ricerca sui fattori che alterano la produzione di apoB e TG come TM6SF2, PNPLA3 e il ruolo di PCSK9 nel controllo del catabolismo delle lipoproteine ​​contenenti apoB. Inoltre, e soprattutto, i ricercatori stanno appena completando uno studio cinetico in un gruppo di portatori di apoCIII LOF che presentano bassi livelli di TG e altri tratti fenotipici paragonabili a quelli osservati in ANGPTL3 LOF (non ancora pubblicati). La disponibilità di questi studi di confronto fornisce uno sfondo metabolico rispetto al quale possiamo valutare le azioni specifiche di ANGPTL3.

La valutazione primaria si concentrerà sulle differenze nei tassi di clearance di VLDL1, VLDL2, IDL e LDL, sui tassi di lipolisi TG in VLDL1 e VLDL2 e sui tassi di conversione di VLDL1/VLDL2 in IDL e LDL nei portatori omozigoti S17X rispetto agli eterozigoti e controlli. La domanda chiave della ricerca è "la carenza o l'assenza di ANGPTL3 determina un aumento della lipolisi e un aumento dei tassi di clearance frazionaria per VLDL2 e IDL (i precursori delle LDL) che quindi porta a una ridotta generazione intravascolare di particelle LDL e possibilmente a una riduzione del livello circolante di residuo lipoproteine”. il ricercatore esplorerà anche un potenziale effetto della dose genica includendo gli eterozigoti nell'analisi statistica. I parametri cinetici chiave saranno testati in modelli ANOVA, con l'inclusione di potenziali fattori confondenti come il sesso e il BMI.

l'ipotesi secondaria che ANGPTL3 agisca per ridurre l'assemblaggio complessivo e la secrezione delle lipoproteine ​​nel fegato sarà testata direttamente confrontando i tassi di produzione di VLDL1, VLDL2, IDL e LDL apoB100, e il tasso di secrezione di VLDL1-TG e VLDL2-TG nei tre gruppi di soggetti.

Ulteriori risultati saranno l'allineamento dei dati composizionali proteomici e lipidomici con la variazione dei parametri cinetici. Se è vero che i portatori di ANGPTL3 LOF hanno livelli molto bassi di particelle residue (e altre lipoproteine ​​aterogeniche), allora la composizione delle frazioni VLDL, IDL e LDL può rivelare una "firma a basso rischio" che è utile quando si valuta l'efficacia degli agenti progettati per abbassare o inibire l'azione ANGPTL3.