Metabolizm in vivo lipoprotein zawierających apoB u osób z niedoborem ANGPTL3

Hipoteza robocza

Ogólna hipoteza robocza jest taka, że ​​normalnym fizjologicznym działaniem ANGPTL3 jest spowolnienie lipolizy i hamowanie klirensu pozostałości przez wątrobę. W ten sposób białko powoduje wzrost strumienia cząstek apoB przechodzących z zakresu gęstości VLDL do LDL, co skutkuje wzrostem netto produkcji LDL. We wcześniejszych badaniach zaobserwowaliśmy, że stopień konwersji VLDL do IDL, a następnie LDL waha się od 25% do 75%.2 Gdzie i jak ANGPTL3 może działać, pozostaje do odkrycia. Porównanie tempa produkcji VLDL1 i VLDL2, tempa lipolizy tych cząstek oraz ilości apoB przekształconego w IDL, a następnie LDL u osób kontrolnych oraz heterozygotycznych i homozygotycznych pod względem wariantów utraty funkcji (LOF) ANGPTL3 umożliwi nam, aby określić, gdzie działa ANGPTL3 i prawdopodobnie ujawnić efekt związany z dawką genu.

Zbadane zostaną również alternatywne hipotezy, w tym możliwość, że przyspieszona lipoliza chylomikronów u nosicieli ANGPTL3 LOF prowadzi do dostarczania do wątroby mniejszej niż normalna ilości trójglicerydów w diecie, co w rezultacie upośledza składanie i wydzielanie VLDL. Sugerowałoby to, że fenotyp hipobetalipoproteinemii wynika przede wszystkim z nieprawidłowości w produkcji wątrobowej. Lub, jak niedawno zasugerowano z badań nad rodzinną hipercholesterolemią, że istnieje stymulacja katabolizmu LDL, gdy aktywność ANGPTL3 jest zmniejszona.

Główne cele

Głównym celem jest zbadanie u osobników heterozygotycznych i homozygotycznych pod względem wariantów LOF ANGPTL3 w porównaniu z dopasowanymi kontrolami:

• Kinetyka apoB48 w chylomikronach i ich pozostałościach w świetle naszych wcześniejszych badań, które ujawniły dramatyczne zmniejszenie chylomikronemii poposiłkowej u homozygotycznych nosicieli LOF.4
• Kinetyka apoB100 w VLDL1, VLDL2, IDL i LDL. Ujawni to podstawę hipobetalipoproteinemii obserwowanej w tym stanie 4-6 i wyjaśni, w jaki sposób częściowa lub całkowita utrata ANGPTL3 prowadzi do niższych poziomów VLDL, pozostałości i LDL.
• Kinetyka TG w VLDL1 i VLDL2. To ujawni, jak zmienia się lipoliza, gdy działanie ANGPTL3 jest osłabione lub nieobecne.

Cele drugorzędne

Naszymi drugorzędnymi celami są zbadanie:

• Wpływ ANGPTL3 na kinetykę kluczowych apolipoprotein regulatorowych apoC-III i apoE, ponieważ doniesiono, że stężenie apoC-III jest niższe, gdy ANGPTL3 jest zmniejszone.
• Szczegółowy skład rodzajów lipoprotein zawierających apoB. Zbadamy profile proteomiczne i lipidomiczne chylomikronów, VLDL1, VLDL2, IDL i LDL w tej wyjątkowej kohorcie, aby lepiej zrozumieć sygnatury składu w tym specyficznym stanie „niskiego ryzyka ASCVD”.

Projekt eksperymentu i podejście Rekrutacja pacjentów: Badani będą rekrutowani na podstawie ich znanego statusu dla wariantu S17X LOF. Osoby te są mieszkańcami wioski Campodimele niedaleko Rzymu we Włoszech. Badacze przez wiele lat nawiązali bliskie i wzajemnie cenione powiązania z mieszkańcami Camapodimele i opublikowali kluczowe cechy fenotypu lipidów, który jest wykazywany przez osoby niosące ANGPTL3 LOF, który jest głęboką połączoną hipolipidemią związaną ze zmniejszonymi poziomami w osoczu całkowitego cholesterolu, TG, VLDL-TG i cholesterolu, cholesterolu LDL, apoB i osłabionej poposiłkowej odpowiedzi trójglicerydowej na testowy posiłek tłuszczowy. Naszym planem jest rekrutacja 4 dostępnych homozygot i identyfikacja 6-8 heterozygot, które wykazują niski poziom ANGPTL3 w osoczu (<150 ng/ml) i niski TG (<120 mg/dl). Dopasowane pod względem wieku i płci zdrowe grupy kontrolne (n = 6-8) bez znanych czynników zakłócających metabolizm lipidów będą również rekrutowane z populacji Campodimele.

Protokół metaboliczny: Badacze opracowali i zwalidowali nowe metody umożliwiające jednoczesne śledzenie kinetyki TG w dużych VLDL1 i mniejszych VLDL2, apoB48 w chylomikronach, VLDL1 i VLDL2, apoB100 w VLDL1, VLDL2, IDL i LDL oraz produkcji i tempa katabolizmu dla apoC-III i apoE. Pacjenci otrzymają zastrzyk 500 mg deuterowanej glicerolu w celu oceny kinetyki triglicerydów oraz zastrzyk deuterowanej leucyny (7 mg/kg masy ciała) w celu oceny kinetyki apoB100, apoB48, apoC-III i apoE. W celu oceny metabolizmu chylomikronów, osobnikom podano standardowy posiłek bogaty w tłuszcz, który zawierał 927 kcal (59,5% tłuszczu (68 g), 24,4% węglowodanów (63 g) i 15,5% białka (40 g) 2 godziny po wstrzyknięciu izotopów. Próbki krwi będą pobierane w częstych punktach czasowych przez 8 godzin, a kolejne próbki krwi będą pobierane następnego ranka (24 godziny) oraz w dniach 2, 3 i 4 po podaniu znacznika. Całkowita objętość krwi pobieranej w okresie badania kinetycznego (około 350 ml) została zmniejszona ze względu na to, że niektórzy z badanych (zwłaszcza homozygoty) są w podeszłym wieku. (Ta objętość oddanej krwi jest uważana za akceptowalną i jest mniejsza od tej, którą zebrano we wcześniejszych badaniach klinicznych w tej populacji). Zmniejszenie ilości pobieranej krwi nie wpływa na naszą zdolność do uzyskania pełnego zestawu parametrów kinetycznych. Badacze najlepiej wykorzystają wysoce czułe techniki analityczne. Zespół kliniczny dr Arcy wykona protokół metaboliczny na miejscu w specjalnych pomieszczeniach klinicznych w Campodimele. Próbki zostaną zabrane do jego laboratorium w Rzymie w celu podzielenia na porcje i wysyłki. Izolacja lipoprotein: Izolacja frakcji lipoprotein do analizy kinetycznej jest czasochłonna i wymaga specjalistycznego sprzętu (ultrawirówki) oraz znacznej wiedzy; izolowanie frakcji TRL od osób z niskim TG w osoczu jest jeszcze większym wyzwaniem. Przygotowanie frakcji lipoproteinowych zostanie zatem podjęte w laboratorium dr. Taskinena w Helsinkach (po transporcie na lodzie z Rzymu). Chylomikrony, VLDL1, VLDL2, IDL i LDL zostaną wyizolowane w dobrze znanej stopniowej procedurze wirowania. Najpierw całkowity TRL zostanie zatężony przez ultrawirowanie (d <1,006 g/ml przez 18 godzin), a następnie ta „górna” frakcja zostanie zebrana i wykorzystana do wyizolowania chylomikronów (Sf > 400), VLDL1 (Sf 60-400) i VLDL2 (Sf 20-60) przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości. Frakcja d>1,006 g/ml („dolna”) zostanie użyta do oddzielenia IDL i LDL w dalszych etapach wirowania sekwencyjnego. Metody te są rutynowo stosowane w laboratorium w Helsinkach. Wyizolowane frakcje lipoprotein są następnie przygotowywane do przeniesienia do Göteborga w celu analizy wzbogacenia. Preparat ten obejmuje pomiar stężenia TG, cholesterolu, fosfolipidów i białek oraz delipidację, precypitację i pomiar apoB. Analiza wzbogacenia izotopów apoprotein i lipidów oraz modelowanie matematyczne: Kolejnym krokiem w badaniach kinetycznych jest analiza wzbogacenia izotopów stabilnych przy użyciu wysokoczułych metod spektrometrii mas. Stężenia lipidów i apolipoprotein (apoB100, apoB48, apoC-III i apoE) zostaną określone za pomocą testów immunologicznych i technik spektrometrii mas w całym osoczu i we frakcjach lipoprotein w każdym punkcie czasowym protokołu metabolicznego. Wzbogacenie izotopowe w apoproteiny i lipidy (trójglicerydy) zostanie przeprowadzone metodą GC/MS. Wszystkie te metody, w tym transfery próbek, są solidne i dobrze ugruntowane w laboratoriach w Helsinkach i Göteborgu i były przedmiotem serii publikacji. Wyniki wzbogacenia izotopowego i stężenia TG/apoproteiny we wszystkich wyizolowanych frakcjach tworzą zbiór danych, na którym prowadzone jest modelowanie wielokompartmentowe. Badacze z powodzeniem opracowali i zastosowali nasze modele do danych pochodzących od osób z różnymi schorzeniami (hipertriglicerydemia, hipotriglicerydemia, cukrzyca), a także z włączaniem i wyłączaniem leczenia hipolipemizującego. Modele mają zastosowanie we wszystkich napotkanych warunkach i wygenerowały nowe spojrzenie na metabolizm lipoprotein.12x-14 Parametry kinetyczne uzyskane z modeli wielokompartmentowych to: Szybkości wytwarzania cząstek apoB48 we frakcjach chylomikronów, VLDL1 i VLDL2. Wskaźniki produkcji apoB100 w VLDL1, VLDL2, IDL i LDL. Szybkości lipolizy dla TG w VLDL1 i VLDL2 Ułamkowe współczynniki klirensu dla cząstek zawierających apoB48 w chylomikronach, VLDL1, VLDL2 oraz dla cząstek zawierających apoB100 w VLDL1, VLDL2, IDL i LDL. Szybkość konwersji chylomikronów do VLDL1 i VLDL2, szybkość konwersji VLDL1 do VLDL2 do IDL i do LDL. Wskaźniki produkcji i klirensu apoC-III i apoE.

Główne miary wyników i wyniki badań. Nie wiadomo, w jaki sposób ANGPTL3 reguluje metabolizm lipoprotein u ludzi, dlatego ważne jest, aby zachować otwarty umysł co do jego dokładnego sposobu działania na kinetykę apoB i TG, jak zbadano w tym badaniu. Nasza hipoteza robocza oparta na dotychczasowych obserwacjach u nosicieli LOF jest taka, że ​​ma on wpływ na wszystkie lipoproteiny zawierające apoB, który różni się od innych czynników regulacyjnych, takich jak te, które zmieniają produkcję lipoprotein – aktywność białka przenoszącego mikrosomalny trójgliceryd (MTP) lub mutacje, które hamują Zespół VLDL1 (TM6SF2) lub te, które zmieniają klirens za pośrednictwem receptora lipoproteinowego, takie jak PCSK9.

Badacze opublikowali niedawno badania czynników, które zmieniają produkcję apoB i TG, takich jak TM6SF2, PNPLA3 i roli PCSK9 w kontrolowaniu katabolizmu lipoprotein zawierających apoB. Co więcej, badacze właśnie kończą badanie kinetyczne w grupie nosicieli apoCIII LOF, którzy wykazują niski poziom TG i inne cechy fenotypowe porównywalne z tymi obserwowanymi w ANGPTL3 LOF (jeszcze nieopublikowane). Dostępność tych badań porównawczych zapewnia tło metaboliczne, na którym możemy ocenić specyficzne działania ANGPTL3.

Podstawowa ocena skupi się na różnicach we wskaźnikach klirensu VLDL1, VLDL2, IDL i LDL, wskaźnikach lipolizy TG w VLDL1 i VLDL2 oraz wskaźnikach konwersji VLDL1/VLDL2 do IDL i LDL u homozygotycznych nosicieli S17X w porównaniu z heterozygotami i kontroli. Kluczowe pytanie badawcze brzmi: „czy niedobór lub brak ANGPTL3 skutkuje zwiększoną lipolizą i zwiększonym współczynnikiem klirensu cząstkowego dla VLDL2 i IDL (prekursorów LDL), co następnie prowadzi do zmniejszenia wewnątrznaczyniowego wytwarzania cząstek LDL i prawdopodobnie zmniejszenia poziomu krążących pozostałości lipoproteiny”. badacz zbada również potencjalny efekt dawki genu poprzez włączenie heterozygot do analizy statystycznej. Kluczowe parametry kinetyczne zostaną przetestowane w modelach ANOVA, z uwzględnieniem potencjalnych czynników zakłócających, takich jak płeć i BMI.

drugorzędna hipoteza, że ​​ANGPTL3 działa w celu zmniejszenia ogólnego gromadzenia i wydzielania lipoprotein w wątrobie, zostanie przetestowana bezpośrednio przez porównanie szybkości wytwarzania VLDL1, VLDL2, IDL i LDL apoB100 oraz szybkości wydzielania VLDL1-TG i VLDL2-TG w trzech grupy przedmiotowe.

Dalszymi wynikami będzie dostosowanie danych składu proteomicznego i lipidomicznego do zmian parametrów kinetycznych. Jeśli jest tak, że nosiciele ANGPTL3 LOF mają bardzo niski poziom cząstek resztkowych (i innych aterogennych lipoprotein), wówczas skład frakcji VLDL, IDL i LDL może ujawnić „sygnaturę niskiego ryzyka”, która jest pomocna przy ocenie skuteczności środków zaprojektowanych obniżać lub hamować działanie ANGPTL3.