In-vivo-Metabolismus von apoB-enthaltenden Lipoproteinen bei Probanden mit ANGPTL3-Mangel

Arbeitshypothese

Die allgemeine Arbeitshypothese lautet, dass die normale physiologische Wirkung von ANGPTL3 darin besteht, die Lipolyse zu verlangsamen und die Restclearance durch die Leber zu hemmen. Auf diese Weise bewirkt das Protein eine Erhöhung des Flusses von apoB-Partikeln, die vom VLDL- in den LDL-Dichtebereich übergehen, was zu einer Nettoerhöhung der LDL-Produktion führt. In früheren Studien haben wir beobachtet, dass das Ausmaß der Umwandlung von VLDL in IDL und dann in LDL zwischen 25 % und 75 % variiert.2 Wo und wie ANGPTL3 wirken könnte, bleibt noch zu entdecken. Ein Vergleich der Raten der VLDL1- und VLDL2-Produktion, der Lipolyseraten dieser Partikel und der Menge an apoB, die in IDL und dann in LDL umgewandelt wurde, bei Kontrollpersonen und solchen, die für ANGPTL3-Funktionsverlust (LOF)-Varianten heterozygot und homozygot waren, wird dies ermöglichen uns, zu beschreiben, wo ANGPTL3 wirkt, und möglicherweise einen Gen-Dosis-bezogenen Effekt aufzudecken.

Es werden auch alternative Hypothesen untersucht, einschließlich der Möglichkeit, dass die beschleunigte Chylomikronen-Lipolyse bei ANGPTL3-LOF-Trägern dazu führt, dass eine subnormale Menge an diätetischem Triglycerid an die Leber abgegeben wird, was als Ergebnis die VLDL-Assemblierung und -Sekretion beeinträchtigt. Dies würde bedeuten, dass der Hypobetalipoproteinämie-Phänotyp hauptsächlich auf eine Anomalie in der hepatischen Produktion zurückzuführen ist. Oder, wie kürzlich aus Studien zur familiären Hypercholesterinämie nahegelegt wurde, dass es eine Stimulierung des LDL-Katabolismus gibt, wenn die ANGPTL3-Aktivität reduziert ist.

Hauptziele

Die Hauptziele bestehen darin, bei Patienten, die heterozygot und homozygot für ANGPTL3-LOF-Varianten sind, im Vergleich zu übereinstimmenden Kontrollen Folgendes zu untersuchen:

• Kinetik von apoB48 in Chylomikronen und ihren Überresten angesichts unserer früheren Untersuchungen, die dramatische Reduktionen der postprandialen Chylomikronämie bei homozygoten LOF-Trägern zeigten.4
• Kinetik von apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL und LDL. Dies wird die Basis für die Hypobetalipoproteinämie zeigen, die in diesem Zustand 4-6 zu sehen ist, und klären, wie ein teilweiser oder vollständiger Verlust von ANGPTL3 zu niedrigeren Spiegeln von VLDL, Resten und LDL führt.
• Kinetik von TG in VLDL1 und VLDL2. Dies wird zeigen, wie die Lipolyse verändert wird, wenn die Wirkung von ANGPTL3 beeinträchtigt ist oder fehlt.

Sekundäre Ziele

Unsere sekundären Ziele sind die Untersuchung von:

• Der Einfluss von ANGPTL3 auf die Kinetik der wichtigsten regulatorischen Apolipoproteine ​​apoC-III und apoE, da berichtet wurde, dass apoC-III in niedrigerer Konzentration vorliegt, wenn ANGPTL3 reduziert ist.
• Die detaillierte Zusammensetzung von apoB-enthaltenden Lipoproteinspezies. Wir werden die proteomischen und lipidomischen Profile von Chylomikronen, VLDL1, VLDL2, IDL und LDL in dieser einzigartigen Kohorte untersuchen, um die Zusammensetzungssignaturen in diesem spezifischen Zustand mit „niedrigem ASCVD-Risiko“ besser zu verstehen.

Experimentelles Design und Ansatz Rekrutierung von Probanden: Probanden werden auf der Grundlage ihres bekannten Status für die S17X-LOF-Variante rekrutiert. Die Personen sind Bewohner des Dorfes Campodimele in der Nähe von Rom, Italien. Die Forscher haben über viele Jahre hinweg eine enge und von beiden Seiten geschätzte Verbindung zu den Menschen in Camapodimele aufgebaut und Schlüsselmerkmale des Lipid-Phänotyps veröffentlicht, den diejenigen aufweisen, die das ANGPTL3 LOF tragen, was eine tiefgreifende kombinierte Hypolipidämie in Verbindung mit reduzierten Plasmaspiegeln insgesamt ist Cholesterin, TG, VLDL-TG und Cholesterin, LDL-Cholesterin, apoB und eine abgestumpfte postprandiale Triglyceridreaktion auf eine fetthaltige Testmahlzeit. Unser Plan ist es, die 4 verfügbaren Homozygoten zu rekrutieren und 6-8 Heterozygote zu identifizieren, die niedrige ANGPTL3-Plasmaspiegel (< 150 ng/ml) und niedrige TG (< 120 mg/dl) aufweisen. Aus der Campodimele-Population werden auch alters- und geschlechtsangepasste gesunde Kontrollen (n=6-8) ohne bekannte Faktoren rekrutiert, die den Lipidstoffwechsel stören.

Stoffwechselprotokoll: Die Forscher haben neuartige Methoden entwickelt und validiert, die es ermöglichen, gleichzeitig die Kinetik von TGs in großen VLDL1 und kleineren VLDL2, apoB48 in Chylomikronen, VLDL1 und VLDL2, apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL und LDL sowie die Produktions- und Abbauraten zu verfolgen für apoC-III und apoE. Die Probanden erhalten eine 500-mg-Injektion von deuteriertem Glycerin zur Beurteilung der Triglyceridkinetik und eine Injektion von deuteriertem Leucin (7 mg/kg Körpergewicht) zur Beurteilung der Kinetik von apoB100, apoB48, apoC-III und apoE. Um den Chylomikronenstoffwechsel zu bewerten, wird den Probanden 2 Stunden nach der Injektion von Isotopen eine fettreiche Standardmahlzeit serviert, die 927 kcal (59,5 % Fett (68 g), 24,4 % Kohlenhydrate (63 g) und 15,5 % Protein (40 g) enthält. Blutproben werden zu häufigen Zeitpunkten für 8 Stunden entnommen, gefolgt von weiteren Blutproben, die am nächsten Morgen (24 Stunden) und an den Tagen 2, 3 und 4 nach der Tracer-Verabreichung entnommen werden. Das über den Zeitraum der kinetischen Studie zu entnehmende Gesamtblutvolumen (ca. 350 ml) wurde reduziert, da einige der Probanden (insbesondere Homozygote) älter sind. (Dieses Volumen an Blutspenden wird als akzeptabel angesehen und liegt unter dem, was in früheren klinischen Studien in dieser Population gesammelt wurde). Die Verringerung der Blutabnahme ändert nichts an unserer Fähigkeit, den vollständigen Satz kinetischer Parameter abzuleiten - Die Ermittler werden die hochempfindlichen Analysetechniken optimal nutzen. Das klinische Team von Dr. Arca führt das Stoffwechselprotokoll vor Ort in speziellen klinischen Räumlichkeiten in Campodimele durch. Die Proben werden zur Aliquotierung und zum Versand in sein Labor in Rom gebracht. Lipoprotein-Isolierung: Die Isolierung von Lipoproteinfraktionen für die kinetische Analyse ist zeitaufwändig und erfordert spezielle Ausrüstung (Ultrazentrifugen) und beträchtliches Fachwissen; Die Isolierung von TRL-Fraktionen von Probanden mit niedrigem Plasma-TG ist sogar noch schwieriger. Die Vorbereitung der Lipoproteinfraktionen wird daher im Labor von Dr. Taskinen in Helsinki (nach dem Transport auf Eis aus Rom) durchgeführt. Chylomikronen, VLDL1, VLDL2, IDL und LDL werden in einem bewährten schrittweisen Zentrifugationsverfahren isoliert. Zuerst wird das Gesamt-TRL durch Ultrazentrifugation konzentriert (d < 1,006 g/ml für 18 Stunden) und dann wird diese „obere“ Fraktion geerntet und verwendet, um Chylomikronen (Sf > 400), VLDL1 (Sf 60–400) und zu isolieren VLDL2 (Sf 20–60) durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Die d>1,006 g/ml („untere“) Fraktion wird verwendet, um IDL und LDL in weiteren aufeinanderfolgenden Zentrifugationsschritten zu trennen. Diese Methoden werden im Helsinki-Labor routinemäßig eingesetzt. Die isolierten Lipoproteinfraktionen werden dann für den Transport nach Göteborg für Anreicherungsanalysen vorbereitet. Diese Präparation umfasst Messungen von TG, Cholesterin, Phospholipiden und Proteinkonzentration sowie Entfettung, Ausfällung und Messung von apoB. Analysen der Anreicherung von Isotopen in Apoproteinen und Lipiden und mathematische Modellierung: Der nächste Schritt in der kinetischen Untersuchung ist die Analyse der Anreicherung stabiler Isotope mit hochempfindlichen massenspektrometrischen Methoden. Die Konzentrationen von Lipiden und Apolipoproteinen (apoB100, apoB48, apoC-III und apoE) werden unter Verwendung von Immunoassay- und Massenspektrometrietechniken im Vollplasma und in Lipoproteinfraktionen zu jedem Zeitpunkt im Stoffwechselprotokoll bestimmt. Die Isotopenanreicherung in Apoproteinen und Lipiden (Triglyceriden) wird mittels GC/MS durchgeführt. Alle diese Methoden, einschließlich des Probentransfers, sind robust und in den Labors von Helsinki und Göteborg gut etabliert und waren Gegenstand einer Reihe von Veröffentlichungen. Die Isotopenanreicherungsergebnisse und TG/Apoprotein-Konzentrationen in allen isolierten Fraktionen bilden den Datensatz, auf dem die Multikompartiment-Modellierung durchgeführt wird. Die Forscher haben unsere Modelle erfolgreich entwickelt und auf Daten angewendet, die von Probanden mit einer Vielzahl von Erkrankungen (Hypertriglyceridämie, Hypotriglyceridämie, Diabetes) sowie mit und ohne lipidsenkende Behandlung stammen. Die Modelle sind auf alle angetroffenen Umgebungen anwendbar und haben neue Einblicke in den Lipoproteinstoffwechsel generiert.12x-14 Aus Multikompartimentmodellen abgeleitete kinetische Parameter sind: Produktionsraten für apoB48-Partikel in den Chylomikronen-, VLDL1- und VLDL2-Fraktionen. Produktionsraten für apoB100 in VLDL1, VLDL2, IDL und LDL. Lipolyseraten für TG in VLDL1 und VLDL2 Raten der fraktionierten Clearance für apoB48-enthaltende Partikel in Chylomikronen, VLDL1, VLDL2, und für apoB100-enthaltende Partikel in VLDL1, VLDL2, IDL und LDL. Umwandlungsraten von Chylomikronen zu VLDL1 und VLDL2, Umwandlungsraten von VLDL1 zu VLDL2 zu IDL und zu LDL. Produktions- und Clearanceraten von apoC-III und apoE.

Hauptergebnismessungen und Studienleistungen. Wie ANGPTL3 den Lipoproteinstoffwechsel beim Menschen reguliert, ist unbekannt, und daher ist es wichtig, seine genaue Wirkungsweise auf die Kinetik von apoB und TG, wie sie in dieser Studie untersucht wird, offen zu halten. Unsere Arbeitshypothese, die auf bisherigen Beobachtungen bei LOF-Trägern basiert, ist, dass es einen Einfluss auf alle apoB-haltigen Lipoproteine ​​hat, der sich von anderen regulatorischen Faktoren unterscheidet, wie z VLDL1-Assembly (TM6SF2) oder solche, die die Lipoproteinrezeptor-vermittelte Clearance verändern, wie PCSK9.

Die Forscher haben kürzlich Forschungsergebnisse zu Faktoren veröffentlicht, die die Produktion von apoB und TG verändern, wie TM6SF2, PNPLA3, und die Rolle von PCSK9 bei der Kontrolle des Katabolismus von apoB-haltigen Lipoproteinen. Darüber hinaus, und das ist wichtig, schließen die Forscher gerade eine kinetische Studie an einer Gruppe von apoCIII-LOF-Trägern ab, die niedrige TG-Spiegel und andere phänotypische Merkmale aufweisen, die mit denen vergleichbar sind, die bei ANGPTL3-LOF beobachtet wurden (noch unveröffentlicht). Die Verfügbarkeit dieser Vergleichsstudien liefert einen metabolischen Hintergrund, vor dem wir die spezifischen Wirkungen von ANGPTL3 bewerten können.

Die primäre Bewertung konzentriert sich auf die Unterschiede in den Clearance-Raten von VLDL1, VLDL2, IDL und LDL, die Raten der TG-Lipolyse in VLDL1 und VLDL2 und die Umwandlungsraten von VLDL1/VLDL2 in IDL und LDL bei homozygoten S17X-Trägern im Vergleich zu Heterozygoten und Kontrollen. Die zentrale Forschungsfrage lautet: „Führt ein Mangel oder Fehlen von ANGPTL3 zu einer erhöhten Lipolyse und erhöhten Raten der fraktionierten Clearance von VLDL2 und IDL (den Vorläufern von LDL), was dann zu einer verringerten intravaskulären Bildung von LDL-Partikeln und möglicherweise zu einer Verringerung des zirkulierenden Restspiegels führt Lipoproteine". Der Prüfarzt wird auch einen möglichen Gen-Dosis-Effekt untersuchen, indem er Heterozygoten in die statistische Analyse einbezieht. Die wichtigsten kinetischen Parameter werden in ANOVA-Modellen unter Einbeziehung potenzieller Störfaktoren wie Geschlecht und BMI getestet.

Die sekundäre Hypothese, dass ANGPTL3 wirkt, um die Gesamtlipoprotein-Montage und -Sekretion in der Leber zu reduzieren, wird direkt getestet, indem die Produktionsraten von VLDL1, VLDL2, IDL und LDL apoB100 und die Sekretionsrate von VLDL1-TG und VLDL2-TG in den dreien verglichen werden Themengruppen.

Weitere Ergebnisse werden darin bestehen, die proteomischen und lipidomischen Zusammensetzungsdaten mit der Variation der kinetischen Parameter in Einklang zu bringen. Wenn ANGPTL3-LOF-Träger sehr geringe Mengen an Restpartikeln (und anderen atherogenen Lipoproteinen) aufweisen, kann die Zusammensetzung der VLDL-Fraktionen, IDL und LDL eine „Low-Risk-Signatur“ aufweisen, die bei der Bewertung der Wirksamkeit der entwickelten Wirkstoffe hilfreich ist um die Wirkung von ANGPTL3 zu verringern oder zu hemmen.