Метаболизм апоВ-содержащих липопротеинов in vivo у субъектов с дефицитом ANGPTL3

Рабочая гипотеза

Общая рабочая гипотеза состоит в том, что нормальное физиологическое действие ANGPTL3 заключается в замедлении липолиза и ингибировании клиренса остатков в печени. Таким образом, белок вызывает увеличение потока частиц апоВ, переходящих из диапазона плотности ЛПОНП в диапазон плотности ЛПНП, что приводит к чистому увеличению продукции ЛПНП. В предыдущих исследованиях мы наблюдали, что степень превращения ЛПОНП в ЛПНП, а затем в ЛПНП варьируется от 25% до 75%.2 Где и как может действовать ANGPTL3, еще предстоит выяснить. Сравнение скорости продукции ЛПОНП1 и ЛПОНП2, скорости липолиза этих частиц и количества апоВ, преобразованного в IDL, а затем в ЛПНП у контрольных субъектов и у гетерозиготных и гомозиготных по вариантам потери функции ANGPTL3 (LOF), позволит нам, чтобы определить, где действует ANGPTL3, и, возможно, выявить эффект, связанный с дозой гена.

Будут также изучены альтернативные гипотезы, в том числе возможность того, что ускоренный липолиз хиломикронов у носителей ANGPTL3 LOF приводит к доставке в печень субнормального количества диетического триглицерида, что в результате ухудшает сборку и секрецию ЛПОНП. Это может означать, что фенотип гипобеталипопротеинемии в первую очередь обусловлен нарушением продукции печени. Или, как недавно было предложено в исследованиях семейной гиперхолестеринемии, стимуляция катаболизма ЛПНП происходит при снижении активности ANGPTL3.

Основные цели

Основные цели состоят в том, чтобы исследовать у субъектов, гетерозиготных и гомозиготных по вариантам LOF ANGPTL3, по сравнению с подобранными контролями:

• Кинетика апоВ48 в хиломикронах и их остатках в свете наших более ранних исследований, которые выявили резкое снижение постпрандиальной хиломикронемии у гомозиготных носителей LOF.4
• Кинетика апоВ100 в ЛПОНП1, ЛПОНП2, ЛПНП и ЛПНП. Это раскроет основу гипобеталипопротеинемии, наблюдаемой при этом состоянии 4-6, и прояснит, как частичная или полная потеря ANGPTL3 приводит к снижению уровня ЛПОНП, остатков и ЛПНП.
• Кинетика ТГ в ЛПОНП1 и ЛПОНП2. Это покажет, как изменяется липолиз, когда действие ANGPTL3 нарушено или отсутствует.

Второстепенные цели

Наши второстепенные цели состоят в том, чтобы исследовать:

• Влияние ANGPTL3 на кинетику ключевых регуляторных аполипопротеинов апоС-III и ароЕ, поскольку сообщалось, что концентрация апоС-III ниже при снижении ANGPTL3.
• Подробный состав видов липопротеинов, содержащих апоВ. Мы изучим протеомные и липидомные профили хиломикронов, ЛПОНП1, ЛПОНП2, ЛПНП и ЛПНП в этой уникальной когорте, чтобы лучше понять особенности состава в этом конкретном состоянии с «низким риском АСССЗ».

План эксперимента и подход Набор субъектов: Субъекты будут набраны на основе их известного статуса для варианта S17X LOF. Эти люди являются жителями деревни Камподимеле недалеко от Рима, Италия. Исследователи на протяжении многих лет установили тесную и взаимовыгодную связь с жителями Камаподимеле и опубликовали ключевые характеристики липидного фенотипа, проявляемого носителями ANGPTL3 LOF, который представляет собой глубокую комбинированную гиполипидемию, связанную со сниженным уровнем общего содержания липидов в плазме крови. холестерин, ТГ, ЛПОНП-ТГ и холестерин, холестерин ЛПНП, апоВ и притупленный постпрандиальный ответ триглицеридов на тестируемую жирную пищу. Наш план состоит в том, чтобы набрать 4 доступных гомозигот и идентифицировать 6-8 гетерозигот с низким уровнем ANGPTL3 в плазме (<150 нг/мл) и низким уровнем ТГ (<120 мг/дл). Здоровые контроли соответствующего возраста и пола (n=6-8) без известных факторов, нарушающих метаболизм липидов, также будут набраны из популяции Campodimele.

Метаболический протокол. Исследователи разработали и утвердили новые методы, позволяющие одновременно отслеживать кинетику ТГ в больших ЛПОНП1 и меньших ЛПОНП2, апоВ48 в хиломикронах, ЛПОНП1 и ЛПОНП2, апоВ100 в ЛПОНП1, ЛПОНП2, ЛПНП и ЛПНП, а также скорость продукции и катаболизма. для апоС-III и апоЕ. Субъекты получат инъекцию 500 мг дейтерированного глицерина для оценки кинетики триглицеридов и инъекцию дейтерированного лейцина (7 мг/кг массы тела) для оценки кинетики апоВ100, апоВ48, апоС-III и апоЕ. Для оценки метаболизма хиломикронов субъектам будет предложена стандартная богатая жирами пища, содержащая 927 ккал (59,5 % жира (68 г), 24,4 % углеводов (63 г) и 15,5 % белка (40 г) через 2 часа после инъекции изотопов. Образцы крови будут браться через частые временные интервалы в течение 8 часов, после чего будут взяты дополнительные образцы крови на следующее утро (24 часа) и на 2, 3 и 4 дни после введения индикатора. Общий объем крови, который необходимо забрать в течение периода кинетического исследования (около 350 мл), был уменьшен с учетом того, что некоторые из субъектов (в частности, гомозиготы) являются пожилыми. (Этот объем донорской крови считается приемлемым и ниже того, что было собрано в более ранних клинических исследованиях у этой популяции). Уменьшение количества взятой крови не влияет на нашу способность получить полный набор кинетических параметров. Исследователи будут наилучшим образом использовать высокочувствительные аналитические методы. Клиническая команда доктора Арки проведет метаболический протокол на месте в специальных клинических помещениях в Камподимеле. Образцы будут доставлены в его лабораторию в Риме для разделения на аликвоты и отправки. Выделение липопротеинов. Выделение фракций липопротеинов для кинетического анализа занимает много времени и требует специального оборудования (ультрацентрифуги) и значительного опыта; выделение фракций TRL от субъектов с низким уровнем ТГ в плазме является еще более сложной задачей. Таким образом, подготовка липопротеиновых фракций будет проводиться в лаборатории доктора Таскинена в Хельсинки (после отправки на льду из Рима). Хиломикроны, ЛПОНП1, ЛПОНП2, ЛПНП и ЛПНП будут выделены в хорошо зарекомендовавшей себя ступенчатой ​​центрифужной процедуре. Сначала общий TRL будет концентрироваться ультрацентрифугированием (d < 1,006 г/мл в течение 18 часов), а затем эта «верхняя» фракция будет собираться и использоваться для выделения хиломикронов (Sf > 400), VLDL1 (Sf 60-400) и VLDL2 (Sf 20-60) ультрацентрифугированием в градиенте плотности. Фракция d>1,006 г/мл («нижняя») будет использоваться для разделения IDL и LDL на последующих последовательных стадиях центрифугирования. Эти методы регулярно используются в лаборатории Хельсинки. Затем выделенные фракции липопротеинов готовят для передачи в Гетеборг для анализа обогащения. Этот препарат включает измерение концентрации ТГ, холестерина, фосфолипидов и белка, а также делипидирование, преципитацию и измерение апоВ. Анализ обогащения изотопов апопротеинами и липидами и математическое моделирование: Следующим шагом в кинетических исследованиях является анализ обогащения стабильными изотопами с использованием высокочувствительных методов масс-спектрометрии. Концентрации липидов и аполипопротеинов (апоВ100, апоВ48, апоС-III и апоЕ) будут определять с использованием методов иммуноанализа и масс-спектрометрии во всей плазме и во фракциях липопротеинов в каждый момент времени в метаболическом протоколе. Изотопное обогащение апопротеинов и липидов (триглицеридов) будет проводиться с использованием ГХ/МС. Все эти методы, включая перенос образцов, являются надежными и хорошо зарекомендовали себя в лабораториях Хельсинки и Гётеборга и были предметом ряда публикаций. Результаты изотопного обогащения и концентрации ТГ/апопротеина во всех выделенных фракциях формируют набор данных, на котором проводится многокомпонентное моделирование. Исследователи успешно разработали и применили наши модели к данным, полученным от субъектов с различными состояниями (гипертриглицеридемия, гипотриглицеридемия, диабет), а также получающих и не принимающих гиполипидемическую терапию. Модели применимы ко всем встречающимся условиям и позволили получить новое представление о метаболизме липопротеинов.12x-14 Кинетические параметры, полученные из многокомпонентных моделей: Скорость образования частиц апоВ48 во фракциях хиломикронов, ЛПОНП1 и ЛПОНП2. Показатели продукции апоВ100 в ЛПОНП1, ЛПОНП2, ЛПНП и ЛПНП. Скорости липолиза ТГ в ЛПОНП1 и ЛПОНП2 Фракционные скорости клиренса апоВ48-содержащих частиц в хиломикронах, ЛПОНП1, ЛПОНП2 и апоВ100-содержащих частиц в ЛПОНП1, ЛПОНП2, ЛПНП и ЛПНП. Скорость преобразования хиломикронов в ЛПОНП1 и ЛПОНП2, скорость преобразования ЛПОНП1 в ЛПОНП2 в ЛПНП и в ЛПНП. Уровень продукции и клиренса апоС-III и апоЕ.

Показатели основных результатов и результаты исследования. Как ANGPTL3 регулирует метаболизм липопротеинов у людей, неизвестно, и поэтому важно непредвзято относиться к его точному способу действия на кинетику апоВ и ТГ, как это исследуется в этом исследовании. Наша рабочая гипотеза, основанная на наблюдениях, проведенных на сегодняшний день у носителей LOF, заключается в том, что он оказывает влияние на все апоВ-содержащие липопротеины, которое отличается от других регуляторных факторов, таких как те, которые изменяют выработку липопротеинов - активность белка микросомального переноса триглицеридов (MTP) или мутации, которые ингибируют Сборка VLDL1 (TM6SF2) или те, которые изменяют клиренс, опосредованный липопротеиновыми рецепторами, такие как PCSK9.

Исследователи недавно опубликовали исследование факторов, которые изменяют продукцию апоВ и ТГ, таких как TM6SF2, PNPLA3, и роли PCSK9 в контроле катаболизма апоВ-содержащих липопротеинов. Кроме того, и это важно, исследователи только что завершили кинетическое исследование в группе носителей apoCIII LOF, которые демонстрируют низкие уровни TG и другие фенотипические признаки, сравнимые с наблюдаемыми у ANGPTL3 LOF (пока еще не опубликовано). Доступность этих сравнительных исследований обеспечивает метаболический фон, на котором мы можем оценить специфические действия ANGPTL3.

Первичная оценка будет сосредоточена на различиях в скорости клиренса ЛПОНП1, ЛПОНП2, ЛПНП и ЛПНП, скорости липолиза ТГ в ЛПОНП1 и ЛПОНП2 и скорости конверсии ЛПОНП1/ЛОНП2 в ЛПНП и ЛПНП у гомозиготных носителей S17X по сравнению с гетерозиготами. и элементы управления. Ключевой вопрос исследования заключается в том, «приводит ли дефицит или отсутствие ANGPTL3 к усилению липолиза и повышению скорости фракционного клиренса ЛПОНП2 и ЛПНП (предшественников ЛПНП), что затем приводит к уменьшению внутрисосудистой генерации частиц ЛПНП и, возможно, к снижению циркулирующего уровня остаточных липопротеиды». исследователь также изучит потенциальный эффект дозы генов, включив гетерозиготы в статистический анализ. Ключевые кинетические параметры будут протестированы в моделях ANOVA с учетом потенциальных искажающих факторов, таких как пол и ИМТ.

Вторичная гипотеза о том, что ANGPTL3 снижает общую сборку и секрецию липопротеинов в печени, будет проверена непосредственно путем сравнения скорости продукции ЛПОНП1, ЛПОНП2, ЛПНП и ЛПНП апоВ100, а также скорости секреции ЛПОНП1-ТГ и ЛПОНП2-ТГ в трех предметные группы.

Дальнейшие результаты будут заключаться в согласовании протеомных и липидомных композиционных данных с изменением кинетических параметров. Если дело обстоит так, что носители ANGPTL3 LOF имеют очень низкие уровни остаточных частиц (и других атерогенных липопротеинов), то состав фракций ЛПОНП, ЛПНП и ЛПНП может выявить «признак низкого риска», который полезен при оценке эффективности разработанных агентов. для снижения или ингибирования действия ANGPTL3.