In vivo metabolisme av apoB-holdige lipoproteiner hos ANGPTL3-mangelfulle personer

Arbeidshypotese

Den generelle arbeidshypotesen er at den normale fysiologiske virkningen til ANGPTL3 er å bremse lipolyse og hemme restclearance av leveren. På denne måten forårsaker proteinet en økning i fluksen av apoB-partikler som går fra VLDL til LDL-tetthetsområdet, noe som resulterer i en netto økning i LDL-produksjon. I tidligere studier har vi observert at omfanget av konvertering av VLDL til IDL og deretter LDL varierer fra 25 % til 75 %2. Hvor og hvordan ANGPTL3 kan opptre gjenstår å finne ut. En sammenligning av hastighetene for VLDL1- og VLDL2-produksjon, hastigheter for lipolyse av disse partiklene og mengden av apoB omdannet til IDL og deretter LDL hos kontrollpersoner og de heterozygote og homozygote for ANGPTL3-varianter med tap av funksjon (LOF) vil muliggjøre oss for å avgrense hvor ANGPTL3 virker, og muligens avsløre en gendoserelatert effekt.

Alternative hypoteser vil også bli undersøkt, inkludert muligheten for at akselerert chylomikron lipolyse i ANGPTL3 LOF-bærere fører til at en subnormal mengde triglyserid i kosten blir levert til leveren som som et resultat svekker VLDL-sammensetning og sekresjon. Dette vil innebære at fenotypen hypobetalipoproteinemi først og fremst skyldes en abnormitet i leverproduksjonen. Eller, som nylig antydet fra studier i familiær hyperkolesterolemi, at det er en stimulering av LDL-katabolisme når ANGPTL3-aktiviteten reduseres.

Primære mål

Hovedmålene er å undersøke i forsøkspersoner som er heterozygote og homozygote for ANGPTL3 LOF-varianter sammenlignet med matchede kontroller:

• Kinetikk av apoB48 i chylomikroner og deres rester i lys av våre tidligere undersøkelser som avslørte dramatiske reduksjoner i post-prandial chylomicronemi hos homozygote LOF-bærere.4
• Kinetikk av apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL og LDL. Dette vil avsløre grunnlaget for hypobetalipoproteinemien sett i denne tilstanden 4-6 og klargjøre hvordan delvis eller fullstendig tap av ANGPTL3 fører til lavere nivåer av VLDL, rester og LDL.
• Kinetikk av TG i VLDL1 og VLDL2. Dette vil avsløre hvordan lipolyse endres når ANGPTL3-virkningen er svekket eller fraværende.

Sekundære mål

Våre sekundære mål er å undersøke:

• Virkningen av ANGPTL3 på kinetikken til de sentrale regulatoriske apolipoproteinene apoC-III og apoE, siden apoC-III har blitt rapportert å være lavere i konsentrasjon når ANGPTL3 reduseres.
• Den detaljerte sammensetningen av apoB-holdige lipoproteinarter. Vi vil utforske de proteomiske og lipidomiske profilene til chylomikroner, VLDL1, VLDL2, IDL og LDL i denne unike kohorten for å forstå ytterligere komposisjonssignaturene i denne spesifikke tilstanden med lav ASCVD-risiko.

Eksperimentell design og tilnærming Rekruttering av emner: Emner vil bli rekruttert på grunnlag av deres kjente status for S17X LOF-varianten. Individene er innbyggere i landsbyen Campodimele, nær Roma, Italia. Etterforskerne har over mange år etablert en nær og gjensidig verdsatt forbindelse med folket i Camapodimele og har publisert nøkkelkarakteristika for lipidfenotypen som vises av de som bærer ANGPTL3 LOF, som er en dyp kombinert hypolipidemi assosiert med reduserte plasmanivåer av totalt. kolesterol, TG, VLDL-TG og kolesterol, LDL-kolesterol, apoB, og en stump post-prandial triglyseridrespons på et fettmåltid. Planen vår er å rekruttere de 4 tilgjengelige homozygotene og identifisere 6-8 heterozygoter som viser lave ANGPTL3 plasmanivåer (<150ng/ml) og lav TG (<120mg/dl). Alders- og kjønnstilpassede friske kontroller (n=6-8) uten kjente faktorer som forstyrrer lipidmetabolismen vil også bli rekruttert fra Campodimele-populasjonen.

Metabolsk protokoll: Etterforskerne har utviklet og validert nye metoder som gjør det mulig å følge kinetikken til TGs i store VLDL1 og mindre VLDL2, apoB48 i chylomikroner, VLDL1 og VLDL2, apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL-produksjon og LDL, for apoC-III og apoE. Forsøkspersonene vil motta en 500 mg injeksjon av deuterert glyserol for å vurdere triglyseridkinetikk, og en injeksjon av deuterert leucin (7 mg/kg kroppsvekt) for å vurdere kinetikken til apoB100, apoB48, apoC-III og apoE. For å evaluere chylomikronmetabolismen vil forsøkspersonene få servert et standard fettrikt måltid som inneholder 927 kcal (59,5 % fett (68 g), 24,4 % karbohydrat (63 g) og 15,5 % protein (40 g) 2 timer etter injeksjon av isotoper. Blodprøver vil bli tatt ved hyppige tidspunkter i 8 timer, etterfulgt av ytterligere blodprøver tatt neste morgen (24 timer) og på dag 2, 3 og 4 etter administrasjon av sporstoff. Det totale blodvolumet som skal tas ut i løpet av den kinetiske studien (ca. 350 ml) har blitt redusert i erkjennelse av at noen av forsøkspersonene (spesielt homozygoter) er eldre. (Dette volumet av bloddonasjon anses som akseptabelt og er under det som er samlet inn i tidligere kliniske studier i denne populasjonen). Reduksjonen i blodtap endrer ikke vår evne til å utlede hele settet av kinetiske parametere - Etterforskerne vil utnytte de svært sensitive analyseteknikkene best mulig. Dr Arcas kliniske team vil utføre den metabolske protokollen på stedet i spesielle kliniske lokaler i Campodimele. Prøver vil bli tatt til laboratoriet hans i Roma for alikvotering og forsendelse. Lipoproteinisolering: Isolering av lipoproteinfraksjoner for kinetisk analyse er tidkrevende og krever spesialisert utstyr (ultrasentrifuger) og betydelig ekspertise; Det er enda mer utfordrende å isolere TRL-fraksjoner fra personer med lav plasma-TG. Preparering av lipoproteinfraksjoner vil derfor bli utført i laboratoriet til Dr Taskinen i Helsingfors (etter sending på is fra Roma). Chylomikroner, VLDL1, VLDL2, IDL og LDL vil bli isolert i en veletablert trinnvis sentrifugalprosedyre. Først vil total TRL bli konsentrert ved ultrasentrifugering (d <1,006 g/ml i 18 timer), og deretter vil denne 'topp' fraksjonen bli høstet og brukt til å isolere chylomikroner (Sf >400), VLDL1 (Sf 60-400), og VLDL2 (Sf 20-60) ved ultrasentrifugering med tetthetsgradient. d>1,006 g/ml ('bunnen') fraksjon vil bli brukt til å skille IDL og LDL i ytterligere sekvensielle sentrifugeringstrinn. Disse metodene brukes rutinemessig i Helsinki-laboratoriet. De isolerte lipoproteinfraksjonene blir deretter klargjort for overføring til Gøteborg for anrikningsanalyser. Dette preparatet innebærer målinger av TG, kolesterol, fosfolipider og proteinkonsentrasjon, og delipidering, utfelling og måling av apoB. Analyser av anrikninger av isotoper i apoproteiner og lipider, og matematisk modellering: Neste trinn i den kinetiske undersøkelsen er analysen av anrikningen av stabile isotoper ved bruk av svært sensitive massespektrometrimetoder. Konsentrasjonene av lipider og apolipoproteiner (apoB100, apoB48, apoC-III og apoE) vil bli bestemt ved bruk av immunoassay og massespektrometriteknikker i helplasma og i lipoproteinfraksjoner på hvert tidspunkt i den metabolske protokollen. Isotopberikelse i apoproteiner og lipider (triglyserider) vil bli utført ved bruk av GC/MS. Alle disse metodene, inkludert prøveoverføringer, er robuste og veletablerte i laboratoriene i Helsingfors og Gøteborg, og har vært gjenstand for en rekke publikasjoner. Resultatene av isotopanrikningen og TG/apoproteinkonsentrasjonene i alle de isolerte fraksjonene danner datasettet som multikompartmentmodelleringen utføres på. Etterforskerne har med suksess utviklet og brukt modellene våre på data hentet fra personer med en rekke tilstander (hypertriglyseridemi, hypotriglyseridemi, diabetes) så vel som av og på lipidsenkende behandling. Modellene er anvendelige for alle innstillinger og har generert ny innsikt i lipoproteinmetabolisme.12x-14 Kinetiske parametere avledet fra multikompartmentelle modeller er: Produksjonshastigheter for apoB48-partikler i chylomikron-, VLDL1- og VLDL2-fraksjonene. Produksjonsrater for apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL og LDL. Lipolysehastigheter for TG i VLDL1 og VLDL2 Fraksjonelle clearancehastigheter for apoB48-holdige partikler i chylomikroner, VLDL1, VLDL2, og for apoB100-holdige partikler i VLDL1, VLDL2, IDL og LDL. Konverteringshastigheter av chylomikroner til VLDL1 og VLDL2, konverteringshastigheter av VLDL1 til VLDL2 til IDL og til LDL. Produksjons- og oppklaringsrater av apoC-III og apoE.

Hovedresultatmål og studieleveranser. Hvordan ANGPTL3 regulerer lipoproteinmetabolismen hos mennesker er ukjent, og derfor er det viktig å holde et åpent sinn med hensyn til dens nøyaktige virkemåte på apoB- og TG-kinetikk som utforsket i denne studien. Arbeidshypotesen vår basert på observasjoner til dags dato i LOF-bærere er at den har en innvirkning på alle apoB-holdige lipoproteiner som er forskjellig fra andre regulatoriske faktorer som de som endrer lipoproteinproduksjon - mikrosomal triglyseridoverføring (MTP) proteinaktivitet eller mutasjoner som hemmer VLDL1-montering (TM6SF2), eller de som endrer lipoproteinreseptormediert clearance som PCSK9.

Etterforskerne har nylig publisert forskning på faktorer som endrer apoB- og TG-produksjonen som TM6SF2, PNPLA3 og rollen til PCSK9 i å kontrollere katabolismen av apoB-holdige lipoproteiner. Videre, og viktigere, fullfører etterforskerne nettopp en kinetisk studie i en gruppe apoCIII LOF-bærere som viser lave TG-nivåer og andre fenotypiske egenskaper som kan sammenlignes med de som er sett i ANGPTL3 LOF (foreløpig upublisert). Tilgjengeligheten til disse komparatorstudiene gir en metabolsk bakgrunn som vi kan evaluere de spesifikke handlingene til ANGPTL3 mot.

Den primære evalueringen vil fokusere på forskjellene i VLDL1, VLDL2, IDL og LDL clearance rater, ratene av TG lipolyse i VLDL1 og VLDL2, og ratene for konvertering av VLDL1/VLDL2 til IDL og LDL hos homozygote S17X bærere sammenlignet med heterozygoter og kontroller. Det sentrale forskningsspørsmålet er "resultater ANGPTL3-mangel eller fravær i økt lipolyse og økte fraksjonerte clearance-rater for VLDL2 og IDL (forløperne til LDL) som deretter fører til redusert intravaskulær generering av LDL-partikler, og muligens reduksjon i det sirkulerende nivået av rester lipoproteiner". etterforskeren vil også utforske en potensiell gendoseeffekt ved å inkludere heterozygoter i den statistiske analysen. De viktigste kinetiske parameterne vil bli testet i ANOVA-modeller, med inkludering av potensielle forstyrrende faktorer som kjønn og BMI.

den sekundære hypotesen om at ANGPTL3 virker for å redusere den totale lipoproteinsamlingen og sekresjonen i leveren vil bli testet direkte ved å sammenligne produksjonshastighetene til VLDL1, VLDL2, IDL og LDL apoB100, og sekresjonshastigheten til VLDL1-TG og VLDL2-TG i de tre faggrupper.

Ytterligere resultater vil være å samordne de proteomiske og lipidomiske komposisjonsdataene med variasjon i kinetiske parametere. Hvis det er tilfelle at ANGPTL3 LOF-bærere har svært lave nivåer av gjenværende partikler (og andre aterogene lipoproteiner), kan sammensetningen av VLDL-fraksjoner, IDL og LDL avsløre en "lavrisikosignatur" som er nyttig når man skal evaluere effektiviteten til midler designet for å senke eller hemme ANGPTL3-virkningen.