In vivo metabolism av apoB-innehållande lipoproteiner hos ANGPTL3-defekta personer

Arbetshypotes

Den övergripande arbetshypotesen är att den normala fysiologiska verkan av ANGPTL3 är att bromsa lipolys och hämma restclearance av levern. På detta sätt orsakar proteinet en ökning av flödet av apoB-partiklar som passerar från VLDL till LDL-densitetsområde, vilket resulterar i en nettoökning i LDL-produktion. I tidigare studier har vi observerat att graden av omvandling av VLDL till IDL och sedan LDL varierar från 25 % till 75 %2. Var och hur ANGPTL3 kan agera återstår att upptäcka. En jämförelse av hastigheterna för VLDL1- och VLDL2-produktion, hastigheter för lipolys av dessa partiklar och mängden apoB som omvandlas till IDL och sedan LDL hos kontrollpersoner och de som är heterozygota och homozygota för ANGPTL3-varianter med förlorad funktion (LOF) kommer att möjliggöra oss för att avgränsa var ANGPTL3 verkar, och möjligen avslöja en gendosrelaterad effekt.

Alternativa hypoteser kommer också att undersökas inklusive möjligheten att accelererad kylomikronlipolys i ANGPTL3 LOF-bärare leder till att en subnormal mängd triglycerider i kosten levereras till levern, vilket som ett resultat försämrar VLDL-sammansättning och utsöndring. Detta skulle innebära att fenotypen hypobetalipoproteinemi främst beror på en abnormitet i leverproduktionen. Eller, som nyligen antytts från studier i familjär hyperkolesterolemi, att det finns en stimulering av LDL-katabolism när ANGPTL3-aktiviteten minskar.

Primära mål

De primära målen är att undersöka hos försökspersoner som är heterozygota och homozygota för ANGPTL3 LOF-varianter jämfört med matchade kontroller:

• Kinetiken för apoB48 i kylomikroner och deras rester i ljuset av våra tidigare undersökningar som avslöjade dramatiska minskningar av postprandial kylomikronemi hos homozygota LOF-bärare.4
• Kinetik för apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL och LDL. Detta kommer att avslöja grunden för den hypobetalipoproteinemi som ses i detta tillstånd 4-6 och klargöra hur partiell eller fullständig förlust av ANGPTL3 leder till lägre nivåer av VLDL, rester och LDL.
• Kinetik för TG i VLDL1 och VLDL2. Detta kommer att avslöja hur lipolysen förändras när ANGPTL3-verkan är nedsatt eller saknas.

Sekundära mål

Våra sekundära mål är att undersöka:

• Effekten av ANGPTL3 på kinetiken för de viktigaste regulatoriska apolipoproteinerna apoC-III och apoE, eftersom apoC-III har rapporterats vara lägre i koncentration när ANGPTL3 reduceras.
• Den detaljerade sammansättningen av apoB-innehållande lipoproteinarter. Vi kommer att utforska de proteomiska och lipidomiska profilerna för chylomikroner, VLDL1, VLDL2, IDL och LDL i denna unika kohort för att ytterligare förstå de sammansättningsmässiga signaturerna i detta specifika tillstånd med "låg ASCVD-risk".

Rekrytering av experimentell design och tillvägagångssätt Ämnesrekrytering: Ämnen kommer att rekryteras på basis av deras kända status för S17X LOF-varianten. Individerna är invånare i byn Campodimele, nära Rom, Italien. Utredarna har under många år etablerat en nära och ömsesidigt värderad förbindelse med människorna i Camapodimele och har publicerat nyckelegenskaper för lipidfenotypen som uppvisas av de som bär ANGPTL3 LOF, som är en djupgående kombinerad hypolipidemi associerad med minskade plasmanivåer av totalt kolesterol, TG, VLDL-TG och kolesterol, LDL-kolesterol, apoB, och ett trubbigt post-prandialt triglyceridsvar på en fettmåltid. Vår plan är att rekrytera de 4 tillgängliga homozygoterna och identifiera 6-8 heterozygoter som uppvisar låga ANGPTL3-plasmanivåer (<150ng/ml) och lågt TG (<120mg/dl). Ålders- och könsmatchade friska kontroller (n=6-8) utan kända faktorer som stör lipidmetabolismen kommer också att rekryteras från Campodimele-populationen.

Metaboliskt protokoll: Utredarna har utvecklat och validerat nya metoder som gör det möjligt att samtidigt följa kinetiken för TGs i stora VLDL1 och mindre VLDL2, apoB48 i chylomikroner, VLDL1 och VLDL2, apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL-produktion och LDL, för apoC-III och apoE. Försökspersonerna kommer att få en 500 mg injektion av deutererad glycerol för att bedöma triglyceridkinetiken, och en injektion av deutererat leucin (7 mg/kg kroppsvikt) för att bedöma kinetiken för apoB100, apoB48, apoC-III och apoE. För att utvärdera chylomikronmetabolism kommer försökspersonerna att serveras en vanlig fettrik måltid som innehåller 927 kcal (59,5 % fett (68 g), 24,4 % kolhydrat (63 g) och 15,5 % protein (40 g) 2 timmar efter injektion av isotoper. Blodprover kommer att tas vid frekventa tidpunkter under 8 timmar följt av ytterligare blodprover som tas nästa morgon (24 timmar) och på dagarna 2, 3 och 4 efter administrering av spårämne. Den totala blodvolymen som ska tas ut under den kinetiska studiens period (cirka 350 ml) har minskats med hänsyn till att vissa av försökspersonerna (speciellt homozygoter) är äldre. (Denna volym av blodgivning anses vara acceptabel och är lägre än vad som har samlats in i tidigare kliniska studier i denna population). Minskningen av blodtapp förändrar inte vår förmåga att härleda hela uppsättningen kinetiska parametrar - Utredarna kommer att utnyttja de mycket känsliga analysteknikerna på bästa sätt. Dr Arcas kliniska team kommer att utföra det metaboliska protokollet på plats i särskilda kliniska lokaler i Campodimele. Prover kommer att tas till hans laboratorium i Rom för alikvotering och transport. Lipoproteinisolering: Isolering av lipoproteinfraktioner för kinetisk analys är tidskrävande och kräver specialiserad utrustning (ultracentrifuger) och stor expertis; Att isolera TRL-fraktioner från försökspersoner med låg plasma-TG är ännu mer utmanande. Beredning av lipoproteinfraktioner kommer därför att utföras i Dr Taskinens laboratorium i Helsingfors (efter transport på is från Rom). Chylomikroner, VLDL1, VLDL2, IDL och LDL kommer att isoleras i en väletablerad stegvis centrifugalprocedur. Först kommer total TRL att koncentreras genom ultracentrifugering (d <1,006 g/ml i 18 timmar) och sedan kommer denna "översta" fraktion att skördas och användas för att isolera chylomikroner (Sf >400), VLDL1 (Sf 60-400) och VLDL2 (Sf 20-60) genom densitetsgradient ultracentrifugering. Fraktionen d>1,006 g/ml ('botten') kommer att användas för att separera IDL och LDL i ytterligare sekventiella centrifugeringssteg. Dessa metoder används rutinmässigt i Helsingfors lab. De isolerade lipoproteinfraktionerna prepareras sedan för överföring till Göteborg för anrikningsanalyser. Denna beredning involverar mätningar av TG, kolesterol, fosfolipider och proteinkoncentration samt delipidering, utfällning och mätning av apoB. Analyser av anrikningar av isotoper i apoproteiner och lipider, och matematisk modellering: Nästa steg i den kinetiska undersökningen är analysen av anrikningen av stabila isotoper med hjälp av mycket känsliga masspektrometrimetoder. Koncentrationerna av lipider och apolipoproteiner (apoB100, apoB48, apoC-III och apoE) kommer att bestämmas med hjälp av immunanalys- och masspektrometritekniker i helplasma och i lipoproteinfraktioner vid varje tidpunkt i det metaboliska protokollet. Isotopberikning av apoproteiner och lipider (triglycerider) kommer att utföras med GC/MS. Alla dessa metoder, inklusive provöverföringar, är robusta och väletablerade i Helsingfors och Göteborgs labb och har varit föremål för en rad publikationer. Isotopanrikningsresultaten och TG/apoproteinkoncentrationer i alla isolerade fraktioner bildar den datauppsättning på vilken den multikompartmentella modelleringen utförs. Utredarna har framgångsrikt utvecklat och tillämpat våra modeller på data från försökspersoner med en mängd olika tillstånd (hypertriglyceridemi, hypotriglyceridemi, diabetes) samt på och av lipidsänkande behandling. Modellerna är tillämpliga på alla inställningar och har genererat nya insikter om lipoproteinmetabolism.12x-14 Kinetiska parametrar härledda från multikompartmentmodeller är: Produktionshastigheter för apoB48-partiklar i chylomikron-, VLDL1- och VLDL2-fraktionerna. Produktionshastigheter för apoB100 i VLDL1, VLDL2, IDL och LDL. Lipolyshastigheter för TG i VLDL1 och VLDL2 Fraktionerade clearancehastigheter för apoB48-innehållande partiklar i chylomikroner, VLDL1, VLDL2 och för apoB100-innehållande partiklar i VLDL1, VLDL2, IDL och LDL. Omvandlingshastigheter av kylomikroner till VLDL1 och VLDL2, omvandlingshastigheter av VLDL1 till VLDL2 till IDL och till LDL. Produktions- och clearancehastigheter av apoC-III och apoE.

Huvudsakliga resultatmått och studieresultat. Hur ANGPTL3 reglerar lipoproteinmetabolism hos människor är okänt och därför är det viktigt att hålla ett öppet sinne för dess exakta verkningssätt på apoB- och TG-kinetiken som utforskats i denna studie. Vår arbetshypotes baserad på observationer hittills i LOF-bärare är att det har en inverkan på alla apoB-innehållande lipoproteiner som skiljer sig från andra regulatoriska faktorer som de som förändrar lipoproteinproduktionen - mikrosomal triglyceridöverföring (MTP) proteinaktivitet eller mutationer som hämmar VLDL1-sammansättning (TM6SF2), eller de som ändrar lipoproteinreceptormedierad clearance såsom PCSK9.

Utredarna har nyligen publicerat forskning om faktorer som förändrar apoB- och TG-produktionen såsom TM6SF2, PNPLA3 och rollen av PCSK9 för att kontrollera katabolismen av apoB-innehållande lipoproteiner. Vidare, och viktigt, utredarna slutför just en kinetisk studie i en grupp av apoCIII LOF-bärare som uppvisar låga TG-nivåer och andra fenotypiska egenskaper jämförbara med de som ses i ANGPTL3 LOF (ännu opublicerade). Tillgängligheten av dessa jämförelsestudier ger en metabolisk bakgrund mot vilken vi kan utvärdera de specifika åtgärderna hos ANGPTL3.

Den primära utvärderingen kommer att fokusera på skillnaderna i VLDL1-, VLDL2-, IDL- och LDL-clearance-hastigheter, graden av TG-lipolys i VLDL1 och VLDL2 och omvandlingshastigheterna av VLDL1/VLDL2 till IDL och LDL hos de homozygota S17X-bärarna jämfört med heterozygoter och kontroller. Den centrala forskningsfrågan är "resulterar ANGPTL3-brist eller frånvaro i ökad lipolys och ökade fraktionerade clearance-hastigheter för VLDL2 och IDL (prekursorerna till LDL) vilket sedan leder till minskad intravaskulär generering av LDL-partiklar och möjligen minskning av den cirkulerande nivån av rester. lipoproteiner". utredaren kommer också att undersöka en potentiell gendoseffekt genom att inkludera heterozygoter i den statistiska analysen. De viktigaste kinetiska parametrarna kommer att testas i ANOVA-modeller, med inkludering av potentiella störande faktorer som kön och BMI.

den sekundära hypotesen att ANGPTL3 verkar för att minska den totala lipoproteinsamlingen och utsöndringen i levern kommer att testas direkt genom att jämföra produktionshastigheterna för VLDL1, VLDL2, IDL och LDL apoB100, och utsöndringshastigheten för VLDL1-TG och VLDL2-TG i de tre ämnesgrupper.

Ytterligare resultat kommer att vara att anpassa de proteomiska och lipidomiska sammansättningsdata med variation i kinetiska parametrar. Om det är så att ANGPTL3 LOF-bärare har mycket låga nivåer av kvarvarande partiklar (och andra aterogena lipoproteiner) kan sammansättningen av VLDL-fraktioner, IDL och LDL avslöja en "lågrisksignatur" som är till hjälp när man utvärderar effektiviteten av medel som utformats för att sänka eller hämma ANGPTL3-verkan.