In vivo metabolismus lipoproteinů obsahujících apoB u jedinců s deficitem ANGPTL3

Pracovní hypotéza

Celková pracovní hypotéza je, že normálním fyziologickým účinkem ANGPTL3 je zpomalit lipolýzu a inhibovat clearance zbytků játry. Tímto způsobem protein způsobuje zvýšení toku částic apoB přecházejících z VLDL do rozmezí hustoty LDL, což má za následek čisté zvýšení produkce LDL. V předchozích studiích jsme pozorovali, že rozsah konverze VLDL na IDL a poté LDL se pohybuje od 25 % do 75 %.2 Kde a jak může ANGPTL3 působit, je třeba ještě zjistit. Porovnání rychlostí produkce VLDL1 a VLDL2, rychlostí lipolýzy těchto částic a množství apoB přeměněného na IDL a poté LDL u kontrolních subjektů a těch heterozygotních a homozygotních pro varianty ztráty funkce ANGPTL3 (LOF) umožní abychom vymezili, kde působí ANGPTL3, a případně odhalili účinek související s dávkou genu.

Budou také prozkoumány alternativní hypotézy, včetně možnosti, že zrychlená lipolýza chylomikronů v nosičích ANGPTL3 LOF vede k podnormálnímu množství dietních triglyceridů, které jsou dodávány do jater, což v důsledku zhoršuje sestavení a sekreci VLDL. To by znamenalo, že fenotyp hypobetalipoproteinemie je primárně způsoben abnormalitou v produkci jater. Nebo, jak nedávno naznačovaly studie o familiární hypercholesterolémii, že dochází ke stimulaci katabolismu LDL, když je snížena aktivita ANGPTL3.

Primární cíle

Primárním cílem je vyšetřit u subjektů heterozygotních a homozygotních pro varianty ANGPTL3 LOF ve srovnání s odpovídajícími kontrolami:

• Kinetika apoB48 v chylomikronech a jejich zbytcích ve světle našich dřívějších výzkumů, které odhalily dramatické snížení postprandiální chylomikronémie u homozygotních nosičů LOF.4
• Kinetika apoB100 ve VLDL1, VLDL2, IDL a LDL. To odhalí základ hypobetalipoproteinémie pozorované u tohoto stavu 4-6 a objasní, jak částečná nebo úplná ztráta ANGPTL3 vede k nižším hladinám VLDL, zbytků a LDL.
• Kinetika TG ve VLDL1 a VLDL2. To odhalí, jak se změní lipolýza, když je účinek ANGPTL3 narušen nebo chybí.

Sekundární cíle

Naším sekundárním cílem je prozkoumat:

• Vliv ANGPTL3 na kinetiku klíčových regulačních apolipoproteinů apoC-III a apoE, protože bylo hlášeno, že apoC-III má nižší koncentraci, když je ANGPTL3 snížen.
• Podrobné složení lipoproteinových druhů obsahujících apoB. Prozkoumáme proteomické a lipidomické profily chylomikronů, VLDL1, VLDL2, IDL a LDL v této jedinečné kohortě, abychom dále porozuměli kompozičním signaturám tohoto specifického stavu s „nízkým rizikem ASCVD“.

Experimentální design a přístup Nábor subjektů: Subjekty budou rekrutovány na základě jejich známého stavu pro variantu S17X LOF. Jednotlivci jsou obyvatelé vesnice Campodimele poblíž Říma v Itálii. Výzkumníci po mnoho let navázali úzké a vzájemně ceněné spojení s lidmi z Camapodimele a publikovali klíčové charakteristiky lipidového fenotypu, který vykazují ti, kteří nesou ANGPTL3 LOF, což je hluboká kombinovaná hypolipidémie spojená se sníženými hladinami celkových plazmatických hladin. cholesterol, TG, VLDL-TG a cholesterol, LDL cholesterol, apoB a ztlumená postprandiální triglyceridová odpověď na testované tučné jídlo. Naším plánem je získat 4 dostupné homozygoty a identifikovat 6-8 heterozygotů, kteří vykazují nízké plazmatické hladiny ANGPTL3 (<150ng/ml) a nízké TG (<120mg/dl). Z populace Campodimele budou také získány zdravé kontroly odpovídající věku a pohlaví (n=6-8) bez známých faktorů narušujících metabolismus lipidů.

Metabolický protokol: Výzkumníci vyvinuli a ověřili nové metody, které umožňují současně sledovat kinetiku TG ve velkých VLDL1 a menších VLDL2, apoB48 v chylomikronech, VLDL1 a VLDL2, apoB100 ve VLDL1, VLDL2, IDL a LDL a rychlost produkce a katabolismu pro apoC-III a apoE. Subjekty dostanou injekci 500 mg deuterovaného glycerolu pro hodnocení kinetiky triglyceridů a injekci deuterovaného leucinu (7 mg/kg tělesné hmotnosti) pro hodnocení kinetiky apoB100, apoB48, apoC-III a apoE. K vyhodnocení metabolismu chylomikronů bude subjektům podáváno standardní jídlo bohaté na tuky, které obsahuje 927 kcal (59,5 % tuku (68 g), 24,4 % sacharidů (63 g) a 15,5 % bílkovin (40 g) 2 hodiny po injekci izotopů. Vzorky krve budou odebírány v častých časových bodech po dobu 8 hodin, po nichž následují další vzorky krve odebrané následující ráno (24 hodin) a ve dnech 2, 3 a 4 po podání indikátoru. Celkový objem krve, který má být odebrán během období kinetické studie (asi 350 ml), byl snížen, protože někteří jedinci (zejména homozygoti) jsou starší. (Tento objem darované krve je považován za přijatelný a je nižší než objem získaný v dřívějších klinických studiích u této populace). Snížení odebrané krve nemění naši schopnost odvodit úplný soubor kinetických parametrů – vyšetřovatelé nejlépe využijí vysoce citlivé analytické techniky. Klinický tým Dr. Arcy provede metabolický protokol na místě ve speciálních klinických prostorách v Campodimele. Vzorky budou odvezeny do jeho laboratoře v Římě k alikvotování a odeslání. Izolace lipoproteinů: Izolace lipoproteinových frakcí pro kinetickou analýzu je časově náročná a vyžaduje specializované vybavení (ultracentrifugy) a značné odborné znalosti; izolace frakcí TRL od subjektů s nízkým plazmatickým TG je ještě náročnější. Příprava lipoproteinových frakcí bude proto prováděna v laboratoři Dr. Taskinena v Helsinkách (po odeslání na ledu z Říma). Chylomikrony, VLDL1, VLDL2, IDL a LDL budou izolovány dobře zavedeným postupným odstředivým postupem. Nejprve bude celkový TRL zakoncentrován ultracentrifugací (d <1,006 g/ml po dobu 18 hodin) a poté bude tato „vrchní“ frakce sklizena a použita k izolaci chylomikronů (Sf >400), VLDL1 (Sf 60-400) a VLDL2 (Sf 20-60) ultracentrifugací s hustotním gradientem. Frakce d>1,006 g/ml ("spodní") bude použita k oddělení IDL a LDL v dalších krocích sekvenční centrifugace. Tyto metody se běžně používají v helsinské laboratoři. Izolované lipoproteinové frakce jsou poté připraveny pro přenos do Göteborgu pro analýzy obohacení. Tato příprava zahrnuje měření koncentrace TG, cholesterolu, fosfolipidů a proteinů a delipidaci, precipitaci a měření apoB. Analýzy obohacení izotopů v apoproteinech a lipidech a matematické modelování: Dalším krokem v kinetickém výzkumu je analýza obohacení stabilních izotopů pomocí vysoce citlivých metod hmotnostní spektrometrie. Koncentrace lipidů a apolipoproteinů (apoB100, apoB48, apoC-III a apoE) budou stanoveny pomocí imunotestů a technik hmotnostní spektrometrie v celé plazmě a v lipoproteinových frakcích v každém časovém bodě metabolického protokolu. Izotopové obohacení o apoproteiny a lipidy (triglyceridy) bude provedeno pomocí GC/MS. Všechny tyto metody, včetně přenosu vzorků, jsou robustní a dobře zavedené v laboratořích v Helsinkách a Göteborgu a byly předmětem řady publikací. Výsledky izotopového obohacení a koncentrace TG/apoproteinu ve všech izolovaných frakcích tvoří soubor dat, na kterém se provádí multikompartmentové modelování. Výzkumníci úspěšně vyvinuli a aplikovali naše modely na data odvozená od subjektů s různými stavy (hypertriglyceridemie, hypotriglyceridemie, diabetes) a také se zapnutou a vypnutou léčbou snižující lipidy. Modely jsou použitelné pro všechna nastavení a přinesly nové poznatky o metabolismu lipoproteinů.12x-14 Kinetické parametry odvozené z multikompartmentových modelů jsou: Rychlosti produkce částic apoB48 v chylomikronech, frakcích VLDL1 a VLDL2. Výrobní rychlosti pro apoB100 ve VLDL1, VLDL2, IDL a LDL. Rychlosti lipolýzy pro TG ve VLDL1 a VLDL2 Míry frakční clearance pro částice obsahující apoB48 v chylomikronech, VLDL1, VLDL2 a pro částice obsahující apoB100 ve VLDL1, VLDL2, IDL a LDL. Rychlosti konverze chylomikronů na VLDL1 a VLDL2, rychlosti konverze VLDL1 na VLDL2 na IDL a na LDL. Rychlost produkce a clearance apoC-III a apoE.

Hlavní výstupní opatření a výstupy studie. Jak ANGPTL3 reguluje metabolismus lipoproteinů u lidí, není známo, a proto je důležité mít otevřenou mysl, pokud jde o jeho přesný způsob působení na kinetiku apoB a TG, jak bylo zkoumáno v této studii. Naše pracovní hypotéza založená na dosavadních pozorováních u nosičů LOF je, že má dopad na všechny lipoproteiny obsahující apoB, který se liší od jiných regulačních faktorů, jako jsou ty, které mění produkci lipoproteinů – aktivita proteinu mikrosomálního transferu triglyceridů (MTP) nebo mutace, které inhibují Sestavení VLDL1 (TM6SF2), nebo ty, které mění clearance zprostředkovanou lipoproteinovým receptorem, jako je PCSK9.

Výzkumníci nedávno publikovali výzkum faktorů, které mění produkci apoB a TG, jako je TM6SF2, PNPLA3 a role PCSK9 při kontrole katabolismu lipoproteinů obsahujících apoB. Dále, a to je důležité, výzkumníci právě dokončují kinetickou studii u skupiny přenašečů apoCIII LOF, kteří vykazují nízké hladiny TG a další fenotypové znaky srovnatelné s těmi, které byly pozorovány u ANGPTL3 LOF (dosud nepublikované). Dostupnost těchto srovnávacích studií poskytuje metabolické pozadí, proti kterému můžeme hodnotit specifické účinky ANGPTL3.

Primární hodnocení se zaměří na rozdíly v rychlostech clearance VLDL1, VLDL2, IDL a LDL, rychlosti lipolýzy TG u VLDL1 a VLDL2 a rychlosti konverze VLDL1/VLDL2 na IDL a LDL u homozygotních přenašečů S17X ve srovnání s heterozygoty a ovládání. Klíčová výzkumná otázka zní: „má nedostatek nebo absence ANGPTL3 za následek zvýšenou lipolýzu a zvýšenou rychlost frakční clearance pro VLDL2 a IDL (prekurzory LDL), což pak vede ke snížení intravaskulární tvorby částic LDL a možná ke snížení hladiny zbytků v oběhu? lipoproteiny“. výzkumník také prozkoumá potenciální účinek gen-dávky zahrnutím heterozygotů do statistické analýzy. Klíčové kinetické parametry budou testovány v modelech ANOVA se zahrnutím potenciálních matoucích faktorů, jako je pohlaví a BMI.

sekundární hypotéza, že ANGPTL3 působí tak, že snižuje celkovou tvorbu lipoproteinů a sekreci v játrech, bude testována přímo porovnáním rychlosti produkce VLDL1, VLDL2, IDL a LDL apoB100 a rychlosti sekrece VLDL1-TG a VLDL2-TG ve třech předmětové skupiny.

Dalšími výsledky bude srovnání proteomických a lipidomických údajů o složení s variacemi v kinetických parametrech. V případě, že nosiče ANGPTL3 LOF mají velmi nízké hladiny zbytkových částic (a jiných aterogenních lipoproteinů), pak složení frakcí VLDL, IDL a LDL může odhalit „signaturu nízkého rizika“, která je užitečná při hodnocení účinnosti navržených látek. ke snížení nebo inhibici působení ANGPTL3.