Metabolismo in vivo de lipoproteínas contendo apoB em indivíduos com deficiência de ANGPTL3

hipótese de trabalho

A hipótese geral de trabalho é que a ação fisiológica normal do ANGPTL3 é retardar a lipólise e inibir a depuração remanescente pelo fígado. Dessa forma, a proteína causa um aumento no fluxo de partículas de apoB que transitam do VLDL para a faixa de densidade do LDL, resultando em um aumento líquido na produção de LDL. Em estudos anteriores, observamos que a extensão da conversão de VLDL em IDL e depois em LDL varia de 25% a 75%.2 Onde e como o ANGPTL3 pode agir ainda precisa ser descoberto. Uma comparação das taxas de produção de VLDL1 e VLDL2, taxas de lipólise dessas partículas e a quantidade de apoB convertida em IDL e, em seguida, LDL em indivíduos de controle e aqueles heterozigotos e homozigotos para variantes de perda de função (LOF) de ANGPTL3 permitirão para delinear onde o ANGPTL3 atua e, possivelmente, revelar um efeito relacionado à dose de gene.

Hipóteses alternativas também serão exploradas, incluindo a possibilidade de que a lipólise acelerada de quilomícrons em portadores de ANGPTL3 LOF leve a uma quantidade subnormal de triglicerídeos dietéticos sendo entregue ao fígado, o que, como resultado, prejudica a montagem e secreção de VLDL. Isso implicaria que o fenótipo de hipobetalipoproteinemia se deve principalmente a uma anormalidade na produção hepática. Ou, como sugerido recentemente a partir de estudos em hipercolesterolemia familiar, há uma estimulação do catabolismo de LDL quando a atividade de ANGPTL3 é reduzida.

Objetivos primários

Os objetivos primários são investigar em indivíduos heterozigotos e homozigotos para variantes de ANGPTL3 LOF em comparação com controles pareados:

• Cinética de apoB48 em quilomícrons e seus remanescentes à luz de nossas investigações anteriores que revelaram reduções dramáticas na quilomicronemia pós-prandial em portadores homozigóticos de LOF.4
• Cinética da apoB100 em VLDL1, VLDL2, IDL e LDL. Isso revelará a base para a hipobetalipoproteinemia observada nessa condição 4-6 e esclarecerá como a perda parcial ou completa de ANGPTL3 leva a níveis mais baixos de VLDL, remanescentes e LDL.
• Cinética de TG em VLDL1 e VLDL2. Isso revelará como a lipólise é alterada quando a ação do ANGPTL3 é prejudicada ou ausente.

Objetivos Secundários

Nossos objetivos secundários são investigar:

• O impacto do ANGPTL3 na cinética das principais apolipoproteínas reguladoras apoC-III e apoE, uma vez que foi relatado que o apoC-III tem menor concentração quando o ANGPTL3 é reduzido.
• A composição detalhada das espécies de lipoproteínas contendo apoB. Exploraremos os perfis proteômicos e lipidômicos de quilomícrons, VLDL1, VLDL2, IDL e LDL nesta coorte única para entender melhor as assinaturas de composição nesta condição específica de 'baixo risco de ASCVD'.

Desenho Experimental e Abordagem Recrutamento de indivíduos: Os indivíduos serão recrutados com base em seu status conhecido para a variante S17X LOF. Os indivíduos são moradores do vilarejo de Campodimele, próximo a Roma, na Itália. Os investigadores estabeleceram ao longo de muitos anos uma conexão estreita e mutuamente valorizada com o povo de Camapodimele e publicaram as principais características do fenótipo lipídico que é exibido por aqueles portadores do ANGPTL3 LOF, que é uma profunda hipolipidemia combinada associada a níveis plasmáticos reduzidos de total colesterol, TG, VLDL-TG e colesterol, colesterol LDL, apoB e uma resposta pós-prandial de triglicerídeos atenuada a uma refeição gordurosa de teste. Nosso plano é recrutar os 4 homozigotos disponíveis e identificar 6-8 heterozigotos que exibem baixos níveis plasmáticos de ANGPTL3 (<150ng/ml) e baixo TG (<120mg/dl). Controles saudáveis ​​pareados por idade e sexo (n=6-8) sem fatores conhecidos que perturbem o metabolismo lipídico também serão recrutados da população de Campodimele.

Protocolo metabólico: Os investigadores desenvolveram e validaram novos métodos que permitem seguir simultaneamente a cinética de TGs em VLDL1 grande e VLDL2 menor, apoB48 em quilomícrons, VLDL1 e VLDL2, apoB100 em VLDL1, VLDL2, IDL e LDL, e a produção e taxas catabólicas para apoC-III e apoE. Os indivíduos receberão uma injeção de 500 mg de glicerol deuterado para avaliar a cinética dos triglicerídeos e uma injeção de leucina deuterada (7 mg/kg de peso corporal) para avaliar a cinética de apoB100, apoB48, apoC-III e apoE. Para avaliar o metabolismo dos quilomícrons, os indivíduos receberão uma refeição padrão rica em gordura que contém 927 kcal (59,5% de gordura (68 g), 24,4% de carboidratos (63 g) e 15,5% de proteína (40 g) 2 horas após a injeção de isótopos. Amostras de sangue serão coletadas em pontos de tempo frequentes por 8 horas, seguidas por mais amostras de sangue coletadas na manhã seguinte (24 horas) e nos dias 2, 3 e 4 após a administração do marcador. O volume total de sangue a ser retirado durante o período do estudo cinético (cerca de 350 ml) foi reduzido em reconhecimento de que alguns dos indivíduos (homozigotos em particular) são idosos. (Este volume de doação de sangue é considerado aceitável e está abaixo do que foi coletado em estudos clínicos anteriores nesta população). A redução no sangue coletado não altera nossa capacidade de derivar o conjunto completo de parâmetros cinéticos - Os investigadores farão o melhor uso das técnicas analíticas altamente sensíveis. A equipe clínica do Dr. Arca realizará o protocolo metabólico no local, em instalações clínicas especiais em Campodimele. As amostras serão levadas ao seu laboratório em Roma para alíquota e envio. Isolamento de lipoproteínas: O isolamento de frações de lipoproteínas para análise cinética é demorado e requer equipamentos especializados (ultracentrífugas) e experiência considerável; isolar frações TRL de indivíduos com baixo TG plasmático é ainda mais desafiador. A preparação das frações de lipoproteínas será, portanto, realizada no laboratório do Dr. Taskinen em Helsinki (após o envio em gelo de Roma). Quilomícrons, VLDL1, VLDL2, IDL e LDL serão isolados em um procedimento centrífugo passo a passo bem estabelecido. Primeiro, o TRL total será concentrado por ultracentrifugação (d <1,006 g/ml por 18 horas) e então esta fração 'top' será coletada e usada para isolar quilomícrons (Sf >400), VLDL1 (Sf 60-400) e VLDL2 (Sf 20-60) por ultracentrifugação de gradiente de densidade. A fração d>1,006 g/ml ('fundo') será usada para separar IDL e LDL em etapas de centrifugação sequencial. Esses métodos são empregados rotineiramente no laboratório de Helsinki. As frações de lipoproteínas isoladas são então preparadas para transferência para Gotemburgo para análises de enriquecimento. Esta preparação envolve medições de concentração de TG, colesterol, fosfolípidos e proteínas, e delipidação, precipitação e medição de apoB. Análises de enriquecimento de isótopos em apoproteínas e lipídios e modelagem matemática: O próximo passo na investigação cinética é a análise do enriquecimento de isótopos estáveis ​​usando métodos de espectrometria de massa altamente sensíveis. As concentrações de lipídios e apolipoproteínas (apoB100, apoB48, apoC-III e apoE) serão determinadas por técnicas de imunoensaio e espectrometria de massa no plasma total e nas frações de lipoproteínas em cada ponto do protocolo metabólico. O enriquecimento isotópico em apoproteínas e lipídeos (triglicerídeos) será realizado por GC/MS. Todos esses métodos, incluindo transferências de amostras, são robustos e bem estabelecidos nos laboratórios de Helsinque e Gotemburgo e foram objeto de uma série de publicações. Os resultados do enriquecimento isotópico e as concentrações de TG/apoproteína em todas as frações isoladas formam o conjunto de dados no qual a modelagem multicompartimental é conduzida. Os investigadores desenvolveram e aplicaram com sucesso nossos modelos a dados derivados de indivíduos com uma variedade de condições (hipertrigliceridemia, hipotrigliceridemia, diabetes), bem como com e sem tratamento hipolipemiante. Os modelos são aplicáveis ​​a todas as configurações encontradas e geraram novos insights sobre o metabolismo das lipoproteínas.12x-14 Os parâmetros cinéticos derivados de modelos multicompartimentais são: Taxas de produção de partículas de apoB48 nas frações de quilomícrons, VLDL1 e VLDL2. Taxas de produção de apoB100 em VLDL1, VLDL2, IDL e LDL. Taxas de lipólise para TG em VLDL1 e VLDL2 Taxas de depuração fracionária para partículas contendo apoB48 em quilomícrons, VLDL1, VLDL2 e para partículas contendo apoB100 em VLDL1, VLDL2, IDL e LDL. Taxas de conversão de quilomícrons para VLDL1 e VLDL2, taxas de conversão de VLDL1 para VLDL2 para IDL e para LDL. Taxas de produção e depuração de apoC-III e apoE.

Principais medidas de resultados e resultados finais do estudo. Como o ANGPTL3 regula o metabolismo da lipoproteína em humanos é desconhecido e, portanto, é importante manter a mente aberta quanto ao seu modo de ação preciso na cinética de apoB e TG, conforme explorado neste estudo. Nossa hipótese de trabalho com base nas observações até o momento em portadores de LOF é que ela tem um impacto em todas as lipoproteínas contendo apoB que é distinta de outros fatores regulatórios, como aqueles que alteram a produção de lipoproteínas - atividade da proteína de transferência microssomal de triglicerídeos (MTP) ou mutações que inibem montagem VLDL1 (TM6SF2), ou aqueles que alteram a depuração mediada por receptor de lipoproteína, como PCSK9.

Os pesquisadores publicaram recentemente pesquisas sobre fatores que alteram a produção de apoB e TG, como TM6SF2, PNPLA3 e o papel de PCSK9 no controle do catabolismo de lipoproteínas contendo apoB. Além disso, e importante, os investigadores estão apenas concluindo um estudo cinético em um grupo de portadores de apoCIII LOF que exibem baixos níveis de TG e outras características fenotípicas comparáveis ​​às observadas no ANGPTL3 LOF (ainda não publicado). A disponibilidade desses estudos comparativos fornece um pano de fundo metabólico contra o qual podemos avaliar as ações específicas do ANGPTL3.

A avaliação primária se concentrará nas diferenças nas taxas de depuração de VLDL1, VLDL2, IDL e LDL, nas taxas de lipólise de TG em VLDL1 e VLDL2 e nas taxas de conversão de VLDL1/VLDL2 para IDL e LDL nos portadores homozigotos S17X em comparação com heterozigotos e controles. A principal questão de pesquisa é "a deficiência ou ausência de ANGPTL3 resulta em aumento da lipólise e aumento das taxas de depuração fracionada para VLDL2 e IDL (os precursores do LDL), o que leva à redução da geração intravascular de partículas de LDL e, possivelmente, à redução do nível circulante de partículas remanescentes lipoproteínas". o investigador também explorará um potencial efeito de dose de gene incluindo heterozigotos na análise estatística. Os principais parâmetros cinéticos serão testados em modelos ANOVA, com inclusão de potenciais fatores de confusão, como sexo e IMC.

a hipótese secundária de que o ANGPTL3 atua na redução da montagem e secreção de lipoproteínas no fígado será testada diretamente comparando as taxas de produção de VLDL1, VLDL2, IDL e LDL apoB100 e a taxa de secreção de VLDL1-TG e VLDL2-TG nos três grupos de assuntos.

Outros resultados serão alinhar os dados de composição proteômica e lipidômica com variação nos parâmetros cinéticos. Se for o caso de portadores de ANGPTL3 LOF terem níveis muito baixos de partículas remanescentes (e outras lipoproteínas aterogênicas), então a composição das frações VLDL, IDL e LDL pode revelar uma 'assinatura de baixo risco' que é útil ao avaliar a eficácia de agentes projetados para diminuir ou inibir a ação do ANGPTL3.