Effet de l'administration de probiotiques sur la composition de la flore intestinale

Sujets de l'étude L'étude a inclus 14 femmes non enceintes en bonne santé. Tous les sujets ont fourni un consentement éclairé écrit. Les sujets devaient (i) être indemnes de maladies systémiques (diabète, maladie auto-immune, cancer), gastro-intestinales ou hépatiques connues pour être associées à des altérations de la flore intestinale, (ii) ne pas être obèses (indice de masse corporelle compris entre de 20 à 25 Kg/m2), et (iii) n'avoir pris aucun agent antimicrobien, probiotique, médicament inhibiteur de l'acide gastrique ou médicament altérant la motilité gastro-intestinale, au cours des 6 semaines précédentes.

Conception de l'étude Chaque sujet a été étudié à 3 moments : (i) à l'inclusion (inscription), (ii) après l'administration d'un probiotique à la dose habituelle pendant quatre semaines et (iii) quatre semaines après l'arrêt de l'administration du probiotique. Chaque sujet a reçu Cap VSL#3, 2 capsules par jour (chaque capsule contient 112,5 milliards de bactéries -- un mélange de 8 bactéries -- Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, et Lactobacillus delbrueckii). À chaque instant, le profil du microbiote intestinal et les réponses immunitaires ont été étudiés.

Étude métagénomique pour l'analyse de la flore intestinale L'analyse pour l'identification et le profilage de la microflore intestinale a été réalisée à l'aide du séquençage de la région V3 du gène de l'acide ribonucléique ribosomal 16S. Ce gène contient neuf régions variables flanquées par des segments conservés dans toutes les bactéries. L'amplification et le séquençage de toute région hypervariable à l'aide d'amorces spécifiques permettent de déterminer la nature de la bactérie (phylum, famille, genre, espèce, etc.). Les régions les plus utilisées sont V3, V4 et V6 ; nous avons utilisé la région V3, en raison de sa résolution taxonomique plus élevée.

Des échantillons de selles ont été prélevés sur des sujets à 3 moments comme indiqué ci-dessus en demandant au sujet de passer les selles dans un récipient stérile propre ; le récipient a été immédiatement congelé et transporté au laboratoire. L'ADN a été isolé de chaque échantillon à l'aide de protocoles standard, quantifié, normalisé et stocké congelé jusqu'à une utilisation ultérieure.

Une amplification par réaction en chaîne par polymérase de la région V3 a été effectuée. Les amplicons purifiés sur gel (avec différentes séquences d'adaptateurs afin que les données de chaque échantillon puissent être séparées au stade de l'analyse) ont été quantifiés, normalisés et regroupés en quantités équimolaires (multiplexage). La bibliothèque multiplexée a été soumise à un contrôle de qualité à l'aide d'une puce à ADN Agilent Bioanalyser.

La bibliothèque de séquençage contenant des amplicons V3 provenant d'un mélange en quantité égale de divers échantillons cliniques a été séquencée à l'aide d'une machine Illumina dans les deux sens. Les lectures de séquences ont été regroupées selon les séquences d'index, soumises à un contrôle de qualité et les séquences dans les deux directions ont été fusionnées pour obtenir une seule lecture. Les données de séquence ont été analysées pour déterminer le profil de la flore intestinale.

Études immunologiques Prélèvement d'échantillons sanguins Du sang veineux (6 ml) a été prélevé dans de l'héparine de lithium/EDTA, (i) à l'inclusion (avant le début de l'administration de probiotiques), (ii) à la fin du traitement probiotique (à 4 semaines) et (iii) ) à 4 semaines après l'arrêt de la prise de probiotiques. A partir de 2,5 ml de sang, le plasma a été séparé et stocké à -70 degrés centigrades. Le sang hépariné restant a été utilisé pour la culture de sang total et pour la mesure des fréquences des cellules Th17 et Treg.

Du sang hépariné a été utilisé et de l'anti-CD28 (1 ug/ml) pour la stimulation des lymphocytes T et du lipopolysaccharide pour la stimulation des macrophages, dans des puits séparés. Les surnageants de culture ont été récoltés après 72 heures et stockés à -70 degrés centigrades. Les niveaux de cytokines (TNF-alpha, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 et IL-4) ont été mesurés dans le surnageant de culture et le plasma à l'aide d'ELISA en sandwich.

Les fréquences Th1, Th2 et Th17 ont été déterminées par stimulation du sang total avec du PMA et de l'ionomycine, suivie d'une coloration des cellules pour CD4 et IFN intracellulaire, IL-4 et IL-1L-17. Pour le dénombrement des Treg, une double coloration pour CD4 et Fox-P3 a été effectuée.

Considérations éthiques L'étude implique l'administration de probiotiques à des sujets sains. Cependant, ceux-ci contiennent des bactéries qui font partie de la flore intestinale normale chez les personnes en bonne santé et donc exemptes de tout effet indésirable. En fait, plusieurs personnes en bonne santé les consomment comme "compléments de santé". Par conséquent, l'administration de ces agents ne devrait pas comporter plus qu'un risque minimal. Les seuls échantillons qu'il est proposé de prélever sont des échantillons de selles et de petits volumes de sang. Aucun résultat clinique n'a été recueilli.