Vliv podávání probiotik na složení střevní flóry

Subjekty studie Studie zahrnovala 14 zdravých netěhotných žen. Všechny subjekty poskytly písemný informovaný souhlas. Subjekty musely (i) být bez systémových (diabetes, autoimunitní onemocnění, rakovina), gastrointestinálních nebo jaterních onemocnění, o kterých je známo, že jsou spojeny se změnami střevní flóry, (ii) být neobézní (index tělesné hmotnosti v rozmezí 20 až 25 kg/m2) a (iii) neužívali v předchozích 6 týdnech žádné antimikrobiální činidlo, probiotika, léky potlačující žaludeční kyselinu nebo léky, které mění gastrointestinální motilitu.

Uspořádání studie Každý subjekt byl studován ve 3 časových bodech: (i) výchozí stav (zařazení), (ii) po podávání probiotika v obvyklé dávce po dobu čtyř týdnů a (iii) čtyři týdny po přerušení podávání probiotik. Každý subjekt dostával Cap VSL#3, 2 kapsle denně (každá kapsle obsahuje 112,5 miliardy bakterií -- směs 8 bakterií -- Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei a Lactobacillus delbrueckii). V každém časovém bodě byl studován profil střevní mikroflóry a imunitní reakce.

Metagenomická studie pro analýzu střevní flóry Analýza pro identifikaci a profilaci střevní mikroflóry byla provedena pomocí sekvenování oblasti V3 genu pro ribozomální ribonukleovou kyselinu 16S. Tento gen obsahuje devět variabilních oblastí lemovaných konzervovanými úseky u všech bakterií. Amplifikace a sekvenování jakékoli hypervariabilní oblasti pomocí specifických primerů může být použito k určení povahy bakterie (kmen, čeleď, rod, druh atd.). Nejpoužívanější regiony jsou V3, V4 a V6; použili jsme region V3 kvůli jeho vyššímu taxonomickému rozlišení.

Vzorky stolice byly odebrány subjektům ve 3 časových bodech, jak je uvedeno výše, a to tak, že byl subjekt požádán, aby vypustil stolici do čisté sterilní nádobky; nádoba byla okamžitě zmrazena a transportována do laboratoře. DNA byla izolována z každého vzorku pomocí standardních protokolů, kvantifikována, normalizována a uložena zmrazená do dalšího použití.

Byla provedena amplifikace oblasti V3 polymerázovou řetězovou reakcí. Gelově purifikované amplikony (s různými adaptorovými sekvencemi, takže data pro každý vzorek lze oddělit ve fázi analýzy) byly kvantifikovány, normalizovány a spojeny v ekvimolárních množstvích (multiplexování). Multiplexovaná knihovna byla podrobena kontrole kvality pomocí Agilent Bioanalyser DNA Chip.

Sekvenační knihovna obsahující amplikony V3 z ekvivalentního množství směsi různých klinických vzorků byla sekvenována pomocí zařízení Illumina v obou směrech. Čtení sekvencí byla sdružena podle indexových sekvencí, podrobena kontrole kvality a sekvence ve dvou směrech byly spojeny dohromady, aby se získalo jediné čtení. Sekvenční data byla analyzována pro stanovení profilu střevní flóry.

Imunologické studie Odběr krevních vzorků Venózní krev (6 ml) byla odebrána v lithium heparinu/EDTA na (i) výchozím stavu (před zahájením podávání probiotik), (ii) na konci probiotické léčby (ve 4 týdnech) a (iii ) 4 týdny po ukončení příjmu probiotik. Z 2,5 ml krve byla oddělena plazma a skladována při -70 stupních Celsia. Zbývající heparinizovaná krev byla použita pro kultivaci plné krve a pro měření frekvencí Th17 a Treg buněk.

Byla použita heparinizovaná krev a anti-CD28 (1 ug/ml) pro stimulaci T buněk a lipopolysacharid pro stimulaci makrofágů, v oddělených jamkách. Kultivační supernatanty byly sklizeny po 72 hodinách a skladovány při -70 stupních Celsia. Hladiny cytokinů (TNF-alfa, IL-10, IFN-gama, IL-12p70, IL-6 a IL-4) byly měřeny v supernatantu kultury a plazmě pomocí sendvičových testů ELISA.

Frekvence Th1, Th2 a Th17 byly stanoveny stimulací plné krve PMA a ionomycinem s následným barvením buněk na CD4 a intracelulární IFN, IL-4 a IL-1L-17. Pro výpočet Treg bylo provedeno duální barvení pro CD4 a Fox-P3.

Etická hlediska Studie zahrnuje podávání probiotik zdravým subjektům. Tyto však obsahují bakterie, které jsou součástí normální střevní flóry u zdravých osob, a proto nemají žádné nežádoucí účinky. Ve skutečnosti je několik zdravých lidí konzumuje jako „zdravotní doplňky“. Podávání těchto látek by tedy nemělo nést více než minimální riziko. Jediné vzorky navržené k odběru jsou vzorky stolice a malé objemy krve. Nebyly shromážděny žádné klinické výsledky.