Efecto de la administración de probióticos en la composición de la flora intestinal

Sujetos de estudio El estudio incluyó a 14 mujeres sanas no embarazadas. Todos los sujetos proporcionaron un consentimiento informado por escrito. Los sujetos debían (i) estar libres de enfermedades sistémicas (diabetes, enfermedades autoinmunes, cáncer), gastrointestinales o hepáticas que se sabe que están asociadas con alteraciones en la flora intestinal, (ii) no ser obesas (índice de masa corporal en el rango de 20 a 25 Kg/m2), y (iii) no haber tomado ningún agente antimicrobiano, probióticos, fármacos supresores de ácido gástrico o fármacos que alteren la motilidad gastrointestinal, en las 6 semanas previas.

Diseño del estudio Cada sujeto se estudió en 3 puntos temporales: (i) línea de base (inscripción), (ii) después de la administración de un probiótico en la dosis habitual durante cuatro semanas y (iii) cuatro semanas después de la interrupción de la administración del probiótico. Cada sujeto recibió Cap VSL#3, 2 cápsulas diarias (cada cápsula contiene 112.500 millones de bacterias, una mezcla de 8 bacterias: Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, y Lactobacillus delbrueckii). En cada momento, se estudiaron el perfil de la microbiota intestinal y las respuestas inmunitarias.

Estudio metagenómico para el análisis de la flora intestinal El análisis para la identificación y el perfilado de la microflora intestinal se realizó utilizando la secuenciación de la región V3 del gen del ácido ribonucleico ribosomal 16S. Este gen contiene nueve regiones variables flanqueadas por tramos conservados en todas las bacterias. La amplificación y secuenciación de cualquier región hipervariable utilizando cebadores específicos se puede utilizar para determinar la naturaleza de la bacteria (filo, familia, género, especie, etc.). Las regiones más utilizadas son V3, V4 y V6; utilizamos la región V3, debido a su mayor resolución taxonómica.

Se recogieron muestras de heces de los sujetos en 3 puntos de tiempo como se indicó anteriormente, pidiéndole al sujeto que pasara las heces a un recipiente limpio y estéril; el recipiente se congeló inmediatamente y se transportó al laboratorio. El ADN se aisló de cada muestra utilizando protocolos estándar, se cuantificó, normalizó y almacenó congelado hasta su uso posterior.

Se realizó la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de la región V3. Los amplicones purificados en gel (con diferentes secuencias adaptadoras para que los datos de cada muestra puedan separarse en la etapa de análisis) se cuantificaron, normalizaron y agruparon en cantidades equimolares (multiplexación). La biblioteca multiplexada se sometió a un control de calidad utilizando un chip de ADN Agilent Bioanalyser.

La biblioteca de secuenciación que contenía amplicones V3 de una mezcla de cantidades equivalentes de varias muestras clínicas se secuenció usando una máquina Illumina en ambas direcciones. Las lecturas de secuencia se agruparon de acuerdo con las secuencias de índice, se sometieron a control de calidad y las secuencias en las dos direcciones se fusionaron para obtener una sola lectura. Los datos de secuencia se analizaron para determinar el perfil de la flora intestinal.

Estudios inmunológicos Recolección de muestras de sangre Se recolectó sangre venosa (6 ml) en heparina de litio/EDTA, al (i) inicio (antes de comenzar la administración de probióticos), (ii) al final del tratamiento con probióticos (a las 4 semanas) y (iii) ) a las 4 semanas después de la interrupción de la ingesta de probióticos. A partir de 2,5 ml de sangre, se separó el plasma y se almacenó a -70 grados centígrados. La sangre heparinizada restante se usó para cultivo de sangre total y para la medición de frecuencias de células Th17 y Treg.

Se utilizó sangre heparinizada y anti-CD28 (1 ug/ml) para estimulación de células T y lipopolisacárido para estimulación de macrófagos, en pocillos separados. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron después de 72 horas y se almacenaron a -70 grados centígrados. Los niveles de citocinas (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 e IL-4) se midieron en el sobrenadante del cultivo y en el plasma mediante ELISA tipo sándwich.

Las frecuencias de Th1, Th2 y Th17 se determinaron mediante estimulación de sangre completa con PMA e ionomicina, seguido de tinción de células para CD4 e IFN intracelular, IL-4 e IL-1L-17. Para la enumeración de Treg, se realizó tinción dual para CD4 y Fox-P3.

Consideraciones éticas El estudio implica la administración de probióticos a sujetos sanos. Sin embargo, estos contienen bacterias que son parte de la flora intestinal normal en personas sanas y, por lo tanto, libres de eventos adversos. De hecho, varias personas saludables los consumen como 'suplementos para la salud'. Por lo tanto, la administración de estos agentes no debería implicar más que un riesgo mínimo. Las únicas muestras que se propone recolectar son muestras de heces y pequeños volúmenes de sangre. No se recogieron resultados clínicos.