腸内細菌叢組成に対するプロバイオティクス投与の影響

研究対象 この研究には、14 人の健康な妊娠していない女性が含まれていました。 すべての被験者は、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 被験者は、(i) 腸内細菌叢の変化に関連することが知られている全身性疾患 (糖尿病、自己免疫疾患、癌)、胃腸疾患または肝臓疾患にかかっていないこと、(ii) 肥満でないこと (体格指数が(iii) 過去 6 週間に、抗菌剤、プロバイオティクス、胃酸抑制薬、または胃腸の運動性を変化させる薬を服用していない。

研究デザイン 各被験者は、(i) ベースライン (登録)、(ii) 通常用量のプロバイオティクスを 4 週間投与した後、および (iii) プロバイオティクス投与を中止してから 4 週間後の 3 つの時点で研究されました。 各被験者は Cap VSL#3 を 1 日 2 カプセル摂取しました (各カプセルには 1,125 億個の細菌が含まれています - 8 種類の細菌の混合物です - Streptococcus thermophilus、Bifido-bacterium breve、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium Infantis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus paracasei、およびラクトバチルス・デルブリュッキー）。 各時点で、腸内細菌叢のプロファイルと免疫応答が研究されました。

腸内細菌叢の分析のためのメタゲノム研究 腸内細菌叢の同定およびプロファイリングのための分析は、16S リボソームリボ核酸遺伝子の V3 領域の配列決定を使用して行われました。 この遺伝子には、すべての細菌で保存されたストレッチが隣接する 9 つの可変領域が含まれています。 特定のプライマーを使用した任意の超可変領域の増幅と配列決定は、細菌の性質 (門、科、属、種など) を決定するために使用できます。 最も広く使用されているリージョンは、V3、V4、および V6 です。分類学的解像度が高いため、V3 領域を使用しました。

糞便検体は、被験者に糞便を清潔な無菌容器に移すように求めることにより、上記のように3つの時点で被験者から収集されました。容器はすぐに凍結され、実験室に運ばれました。 標準的なプロトコルを使用して各標本から DNA を分離し、定量化し、正規化し、さらに使用するまで凍結保存しました。

V3領域のポリメラーゼ連鎖反応増幅を行った。 ゲル精製アンプリコン（各サンプルのデータを分析段階で分離できるように異なるアダプター配列を使用）を定量化し、正規化し、等モル量でプールしました（多重化）。 多重化されたライブラリーは、Agilent Bioanalyser DNA Chip を使用して品質管理を受けました。

さまざまな臨床サンプルの等量混合物からの V3 アンプリコンを含むシーケンス ライブラリは、イルミナ マシンを使用して両方向でシーケンスされました。 シーケンスリードは、インデックスシーケンスに従ってビニングされ、品質管理を受け、2方向のシーケンスが融合されて単一のリードが得られました。 配列データを分析して、腸内フローラのプロファイルを決定しました。

免疫学的研究 血液検体の採取 静脈血 (6 ml) は、(i) ベースライン (プロバイオティクス投与開始前)、(ii) プロバイオティクス治療の終了時 (4 週間)、および (iii) リチウム ヘパリン/EDTA で採取されました。 ) プロバイオティクスの摂取を中止してから 4 週間後。 2.5mlの血液から血漿を分離し、-70℃で保存した。 残りのヘパリン化血液は、全血培養と、Th17 および Treg 細胞の頻度の測定に使用されました。

ヘパリン化血液を使用し、Ｔ細胞の刺激には抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）を、マクロファージの刺激にはリポ多糖を別々のウェルに入れた。 72時間後に培養上清を回収し、-70℃で保存した。 サイトカイン (TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-12p70、IL-6、および IL-4) のレベルは、サンドイッチ ELISA を使用して培養上清および血漿で測定されました。

Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７頻度は、全血をＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激し、続いてＣＤ４および細胞内ＩＦＮ、ＩＬ－４およびＩＬ－１Ｌ－１７について細胞を染色することによって決定した。 Tregの列挙のために、CD4とFox-P3の二重染色が行われました。

倫理上の考慮事項 この研究には、健康な被験者へのプロバイオティクスの投与が含まれます。 ただし、これらには健康な人の正常な腸内細菌叢の一部である細菌が含まれているため、有害事象はありません. 実際、何人かの健康な人がこれらを「健康補助食品」として消費しています. したがって、これらの薬剤の投与は、最小限のリスクを超えるべきではありません。 採取が提案されている唯一の検体は、便検体と少量の血液です。 臨床転帰は収集されませんでした。