Probioottihoidon vaikutus suolistoflooran koostumukseen

Tutkimuskohteet Tutkimukseen osallistui 14 tervettä ei-raskaana olevaa naista. Kaikki tutkittavat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksen. Koehenkilöillä ei (i) täytynyt olla systeemisiä (diabetes, autoimmuunisairaus, syöpä), maha-suolikanavan tai maksasairauksia, joiden tiedetään liittyvän suolistoflooran muutoksiin, (ii) olla ei-lihavia (painoindeksi alueella 20–25 kg/m2) ja (iii) ei ole käyttänyt mitään antimikrobisia aineita, probiootteja, mahahappoa vähentäviä lääkkeitä tai lääkkeitä, jotka muuttavat ruoansulatuskanavan motiliteettia viimeisten 6 viikon aikana.

Tutkimussuunnitelma Jokaista koehenkilöä tutkittiin 3 ajankohtana: (i) lähtötilanne (ilmoittautuminen), (ii) probiootin antamisen jälkeen tavallisena annoksena neljän viikon ajan ja (iii) neljä viikkoa probioottien annon lopettamisen jälkeen. Jokainen koehenkilö sai Cap VSL#3:a, 2 kapselia päivässä (jokainen kapseli sisältää 112,5 miljardia bakteeria - 8 bakteerin seos - Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus, paractobacillus ja Lactobacillus delbrueckii). Jokaisena ajankohtana tutkittiin suoliston mikrobiotaprofiilia ja immuunivasteita.

Metagenominen tutkimus suolistoflooran analysoimiseksi Analyysi suoliston mikroflooran tunnistamiseksi ja profiloimiseksi tehtiin käyttämällä ribosomaalisen ribosomaalisen ribonukleiinihappogeenin 16S V3-alueen sekvensointia. Tämä geeni sisältää yhdeksän vaihtelevaa aluetta, joita reunustavat säilyneet osuudet kaikissa bakteereissa. Minkä tahansa hypervariaabelin alueen monistamista ja sekvensointia käyttämällä spesifisiä alukkeita voidaan käyttää määrittämään bakteerin luonne (perhe, perhe, suku, laji jne.). Yleisimmin käytetyt alueet ovat V3, V4 ja V6; käytimme V3-aluetta sen korkeamman taksonomisen resoluution vuoksi.

Ulostenäyte kerättiin koehenkilöiltä 3 ajankohdassa, kuten edellä on osoitettu, pyytämällä koehenkilöä kuljettamaan uloste puhtaaseen steriiliin astiaan; astia jäädytettiin välittömästi ja kuljetettiin laboratorioon. DNA eristettiin jokaisesta näytteestä käyttämällä standardiprotokollia, kvantifioitiin, normalisoitiin ja säilytettiin pakastettuna myöhempään käyttöön asti.

V3-alueen polymeraasiketjureaktion monistaminen suoritettiin. Geelillä puhdistetut amplikonit (joilla on erilaiset sovitinsekvenssit, jotta kunkin näytteen tiedot voidaan erottaa analyysivaiheessa) kvantifioitiin, normalisoitiin ja yhdistettiin ekvimolaarisissa määrissä (multipleksointi). Multipleksoitu kirjasto alistettiin laadunvalvontaan käyttämällä Agilent Bioanalyser DNA Chip -sirua.

Sekvensointikirjasto, joka sisälsi V3-amplikoneja eri kliinisten näytteiden yhtä suuresta seoksesta, sekvensoitiin käyttämällä Illumina-konetta molempiin suuntiin. Sekvenssilukemat yhdistettiin indeksisekvenssien mukaisesti, alistettiin laadunvalvontaan ja molempien suuntien sekvenssit fuusioitiin yhteen yhden lukeman saamiseksi. Sekvenssitiedot analysoitiin suolistoflooran profiilin määrittämiseksi.

Immunologiset tutkimukset Verinäytteiden kerääminen Laskimoveri (6 ml) kerättiin litiumhepariini/EDTA:ssa (i) lähtötilanteessa (ennen probioottihoidon aloittamista), (ii) probioottihoidon lopussa (4 viikon kohdalla) ja (iii) ) 4 viikon kuluttua probioottien käytön lopettamisesta. 2,5 ml:sta verta erotettiin plasma ja säilytettiin -70 celsiusasteessa. Jäljelle jäänyt heparinisoitu veri käytettiin kokoveriviljelyyn ja Th17- ja Treg-solujen frekvenssien mittaamiseen.

Käytettiin heparinisoitua verta ja anti-CD28:aa (1 ug/ml) T-solujen stimulointiin ja lipopolysakkaridia makrofagien stimulaatioon erillisissä kuopissa. Viljelmän supernatantit kerättiin 72 tunnin kuluttua ja säilytettiin -70 celsiusasteessa. Sytokiinien (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 ja IL-4) tasot mitattiin viljelmän supernatantista ja plasmasta käyttämällä sandwich-ELISA-testejä.

Th1-, Th2- ja Th17-taajuudet määritettiin stimuloimalla kokoverta PMA:lla ja ionomysiinillä, mitä seurasi solujen värjäys CD4:n ja solunsisäisen IFN:n, IL-4:n ja IL-1L-17:n suhteen. Treg-laskentaa varten tehtiin kaksoisvärjäys CD4:lle ja Fox-P3:lle.

Eettiset näkökohdat Tutkimukseen sisältyy probioottien antaminen terveille koehenkilöille. Ne sisältävät kuitenkin bakteereja, jotka ovat osa terveiden ihmisten normaalia suolistoflooraa ja siten vapaita haittavaikutuksista. Itse asiassa useat terveet ihmiset kuluttavat näitä "terveyslisäravinteina". Siksi näiden aineiden antamiseen ei pitäisi liittyä enempää kuin minimaalista riskiä. Ainoat kerättäväksi ehdotetut näytteet ovat ulostenäytteitä ja pieniä määriä verta. Kliinisiä tuloksia ei kerätty.