Влияние введения пробиотиков на состав кишечной флоры

Субъекты исследования В исследовании приняли участие 14 здоровых небеременных женщин. Все испытуемые дали письменное информированное согласие. Субъекты должны были (i) не иметь системных (диабет, аутоиммунные заболевания, рак), заболеваний желудочно-кишечного тракта или печени, которые, как известно, связаны с изменениями кишечной флоры, (ii) не иметь ожирения (индекс массы тела в диапазоне от 20 до 25 кг/м2) и (iii) не принимали какие-либо противомикробные препараты, пробиотики, препараты, подавляющие кислотность желудка, или препараты, изменяющие моторику желудочно-кишечного тракта, в течение предшествующих 6 недель.

Дизайн исследования Каждый субъект изучался в 3 временных точках: (i) исходный уровень (зачисление), (ii) после приема пробиотика в обычной дозе в течение четырех недель и (iii) через четыре недели после прекращения приема пробиотика. Каждый субъект получал Cap VSL#3 по 2 капсулы в день (каждая капсула содержит 112,5 млрд бактерий — смесь 8 бактерий — Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, и Lactobacillus delbrueckii). В каждый момент времени изучали профиль микробиоты кишечника и иммунные реакции.

Метагеномное исследование для анализа кишечной флоры Анализ для идентификации и профилирования кишечной микрофлоры проводили с использованием секвенирования области V3 рибосомального гена рибонуклеиновой кислоты 16S. Этот ген содержит девять вариабельных областей, окруженных консервативными участками у всех бактерий. Амплификацию и секвенирование любой гипервариабельной области с использованием специфических праймеров можно использовать для определения природы бактерии (тип, семейство, род, вид и т. д.). Наиболее широко используемыми регионами являются V3, V4 и V6; мы использовали регион V3 из-за его более высокого таксономического разрешения.

Образцы стула были собраны у субъектов в 3 временных точках, как указано выше, путем просьбы субъекта испражняться в чистый стерильный сосуд; сосуд был немедленно заморожен и доставлен в лабораторию. ДНК выделяли из каждого образца с использованием стандартных протоколов, определяли количество, нормализовали и хранили в замороженном виде до дальнейшего использования.

Проведена амплификация участка V3 методом полимеразной цепной реакции. Очищенные гелем ампликоны (с различными адаптерными последовательностями, чтобы данные для каждого образца можно было разделить на этапе анализа) количественно определяли, нормализовали и объединяли в эквимолярных количествах (мультиплексирование). Мультиплексированную библиотеку подвергали контролю качества с использованием ДНК-чипа Agilent Bioanalyser.

Библиотека секвенирования, содержащая ампликоны V3 из равного количества смеси различных клинических образцов, была секвенирована с использованием аппарата Illumina в обоих направлениях. Прочтения последовательностей были объединены в ячейки в соответствии с индексными последовательностями, подвергнуты контролю качества, и последовательности в двух направлениях были объединены вместе для получения одного чтения. Данные последовательности были проанализированы для определения профиля кишечной флоры.

Иммунологические исследования Сбор образцов крови Венозную кровь (6 мл) собирали в растворе литий-гепарин/ЭДТА в (i) исходном состоянии (до начала введения пробиотиков), (ii) в конце лечения пробиотиками (через 4 недели) и (iii ) через 4 недели после прекращения приема пробиотиков. Из 2,5 мл крови отделяли плазму и хранили при -70°С. Оставшуюся гепаринизированную кровь использовали для посева цельной крови и для измерения частот клеток Th17 и Treg.

Использовали гепаринизированную кровь и анти-CD28 (1 мкг/мл) для стимуляции Т-клеток и липополисахарид для стимуляции макрофагов в отдельных лунках. Супернатанты культур собирали через 72 часа и хранили при -70°С. Уровни цитокинов (TNF-альфа, IL-10, IFN-гамма, IL-12p70, IL-6 и IL-4) измеряли в культуральном супернатанте и плазме с использованием сэндвич-ELISA.

Частоты Th1, Th2 и Th17 определяли путем стимуляции цельной крови PMA и иономицином с последующим окрашиванием клеток на CD4 и внутриклеточный IFN, IL-4 и IL-1L-17. Для подсчета Treg проводили двойное окрашивание на CD4 и Fox-P3.

Этические соображения Исследование включает введение пробиотиков здоровым субъектам. Однако они содержат бактерии, которые являются частью нормальной кишечной флоры здоровых людей и, следовательно, не вызывают побочных эффектов. На самом деле, несколько здоровых людей потребляют их в качестве «добавок для здоровья». Следовательно, введение этих агентов не должно нести более чем минимальный риск. Единственными образцами, которые предлагается собирать, являются образцы кала и небольшие объемы крови. Клинические исходы не собирались.