Effetto della somministrazione di probiotici sulla composizione della flora intestinale

Soggetti dello studio Lo studio ha incluso 14 donne sane non gravide. Tutti i soggetti hanno fornito un consenso informato scritto. I soggetti dovevano (i) essere esenti da malattie sistemiche (diabete, malattie autoimmuni, cancro), gastrointestinali o epatiche note per essere associate ad alterazioni della flora intestinale, (ii) non essere obesi (indice di massa corporea compreso tra da 20 a 25 kg/m2) e (iii) non aver assunto nelle 6 settimane precedenti alcun agente antimicrobico, probiotici, farmaci antiacido gastrico o farmaci che alterano la motilità gastrointestinale.

Disegno dello studio Ciascun soggetto è stato studiato in 3 punti temporali: (i) basale (arruolamento), (ii) dopo la somministrazione di un probiotico alla dose abituale per quattro settimane e (iii) quattro settimane dopo l'interruzione della somministrazione del probiotico. Ogni soggetto ha ricevuto Cap VSL#3, 2 capsule al giorno (ogni capsula contiene 112,5 miliardi di batteri -- una miscela di 8 batteri -- Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, e Lactobacillus delbrueckii). In ogni momento sono stati studiati il ​​profilo del microbiota intestinale e le risposte immunitarie.

Studio metagenomico per l'analisi della flora intestinale L'analisi per l'identificazione e il profilo della microflora intestinale è stata eseguita utilizzando il sequenziamento della regione V3 del gene dell'acido ribonucleico ribosomiale 16S. Questo gene contiene nove regioni variabili fiancheggiate da tratti conservati in tutti i batteri. L'amplificazione e il sequenziamento di qualsiasi regione ipervariabile utilizzando primer specifici possono essere utilizzati per determinare la natura del batterio (phylum, famiglia, genere, specie, ecc.). Le regioni più utilizzate sono V3, V4 e V6; abbiamo utilizzato la regione V3, a causa della sua maggiore risoluzione tassonomica.

I campioni di feci sono stati raccolti dai soggetti in 3 punti temporali come indicato sopra chiedendo al soggetto di passare le feci in un recipiente sterile pulito; il recipiente è stato immediatamente congelato e trasportato in laboratorio. Il DNA è stato isolato da ciascun campione utilizzando protocolli standard, quantificato, normalizzato e conservato congelato fino a ulteriore utilizzo.

È stata eseguita l'amplificazione della reazione a catena della polimerasi della regione V3. Gli ampliconi purificati con gel (con diverse sequenze di adattatori in modo che i dati per ciascun campione possano essere separati in fase di analisi) sono stati quantificati, normalizzati e raggruppati in quantità equimolari (multiplexing). La libreria multiplexata è stata sottoposta a controllo di qualità utilizzando un Agilent Bioanalyser DNA Chip.

La libreria di sequenziamento contenente ampliconi V3 da una miscela di quantità equivalente di vari campioni clinici è stata sequenziata utilizzando una macchina Illumina in entrambe le direzioni. Le letture di sequenza sono state raggruppate in base a sequenze di indice, sottoposte a controllo di qualità e le sequenze nelle due direzioni sono state fuse insieme per ottenere un'unica lettura. I dati di sequenza sono stati analizzati per determinare il profilo della flora intestinale.

Studi immunologici Raccolta di campioni di sangue Il sangue venoso (6 ml) è stato raccolto in litio eparina/EDTA, (i) basale (prima di iniziare la somministrazione di probiotici), (ii) alla fine del trattamento probiotico (a 4 settimane) e (iii ) a 4 settimane dopo l'interruzione dell'assunzione di probiotici. Da 2,5 ml di sangue, il plasma è stato separato e conservato a -70 gradi centigradi. Il restante sangue eparinizzato è stato utilizzato per la coltura del sangue intero e per la misurazione delle frequenze delle cellule Th17 e Treg.

È stato utilizzato sangue eparinizzato e anti-CD28 (1 ug/ml) per la stimolazione delle cellule T e lipopolisaccaride per la stimolazione dei macrofagi, in pozzetti separati. I supernatanti della coltura sono stati raccolti dopo 72 ore e conservati a -70 gradi centigradi. I livelli di citochine (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 e IL-4) sono stati misurati nel surnatante di coltura e nel plasma utilizzando ELISA a sandwich.

Le frequenze Th1, Th2 e Th17 sono state determinate mediante stimolazione del sangue intero con PMA e ionomicina, seguita dalla colorazione delle cellule per CD4 e IFN intracellulare, IL-4 e IL-1L-17. Per l'enumerazione di Treg, è stata eseguita la doppia colorazione per CD4 e Fox-P3.

Considerazioni etiche Lo studio prevede la somministrazione di probiotici a soggetti sani. Tuttavia, questi contengono batteri che fanno parte della normale flora intestinale nelle persone sane e quindi privi di eventi avversi. In effetti, molte persone sane li consumano come "integratori per la salute". Pertanto, la somministrazione di questi agenti non dovrebbe comportare più di un rischio minimo. Gli unici campioni proposti per la raccolta sono campioni di feci e piccoli volumi di sangue. Non sono stati raccolti risultati clinici.