Effect van probiotische toediening op de samenstelling van de darmflora

Studieonderwerpen De studie omvatte 14 gezonde niet-zwangere vrouwen. Alle proefpersonen verstrekten een schriftelijke geïnformeerde toestemming. De proefpersonen moesten (i) vrij zijn van systemische (diabetes, auto-immuunziekte, kanker), gastro-intestinale of leverziekten waarvan bekend is dat ze verband houden met veranderingen in de darmflora, (ii) niet zwaarlijvig zijn (body mass index in het bereik van 20 tot 25 kg/m2), en (iii) in de voorgaande 6 weken geen antimicrobiële middelen, probiotica, maagzuurremmers of geneesmiddelen die de gastro-intestinale motiliteit veranderen hebben gebruikt.

Onderzoeksopzet Elke proefpersoon werd op 3 tijdstippen bestudeerd: (i) basislijn (inschrijving), (ii) na toediening van een probioticum in de gebruikelijke dosis gedurende vier weken, en (iii) vier weken na stopzetting van de toediening van probiotica. Elke proefpersoon kreeg Cap VSL#3, 2 capsules per dag (elke capsule bevat 112,5 miljard bacteriën -- een mengsel van 8 bacteriën -- Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, en Lactobacillus delbrueckii). Op elk tijdstip werden het profiel van de darmmicrobiota en immuunresponsen bestudeerd.

Metagenomische studie voor analyse van darmflora Analyse voor identificatie en profilering van darmmicroflora werd uitgevoerd met behulp van sequentiebepaling van het V3-gebied van het 16S ribosomale ribonucleïnezuurgen. Dit gen bevat negen variabele regio's geflankeerd door geconserveerde stukken in alle bacteriën. Amplificatie en sequentiebepaling van elk hypervariabel gebied met behulp van specifieke primers kan worden gebruikt om de aard van de bacterie te bepalen (stam, familie, geslacht, soort, enz.). De meest gebruikte regio's zijn V3, V4 en V6; we gebruikten de V3-regio vanwege de hogere taxonomische resolutie.

Er werden ontlastingsmonsters van proefpersonen verzameld op 3 tijdstippen zoals hierboven aangegeven door de proefpersoon te vragen de ontlasting in een schone, steriele bak te doen; het recipiënt werd onmiddellijk ingevroren en naar het laboratorium vervoerd. DNA werd uit elk monster geïsoleerd met behulp van standaardprotocollen, gekwantificeerd, genormaliseerd en ingevroren bewaard tot verder gebruik.

Polymerase-kettingreactie-amplificatie van het V3-gebied werd uitgevoerd. Gel-gezuiverde amplicons (met verschillende adaptersequenties zodat gegevens voor elk monster kunnen worden gescheiden in de analysefase) werden gekwantificeerd, genormaliseerd en samengevoegd in equimolaire hoeveelheden (multiplexing). De gemultiplexte bibliotheek werd onderworpen aan kwaliteitscontrole met behulp van een Agilent Bioanalyser DNA-chip.

De sequencing-bibliotheek die V3-amplicons bevat van een mengsel van gelijke hoeveelheden van verschillende klinische monsters werd gesequenced met behulp van een Illumina-machine in beide richtingen. De uitlezingen van de sequenties werden ingedeeld volgens indexreeksen, onderworpen aan kwaliteitscontrole en sequenties in de twee richtingen werden samengesmolten om één enkele uitlezing te verkrijgen. De sequentiegegevens werden geanalyseerd om het profiel van de darmflora te bepalen.

Immunologische onderzoeken Afname van bloedspecimens Veneus bloed (6 ml) werd afgenomen in lithiumheparine/EDTA, bij (i) baseline (vóór aanvang van de toediening van probiotica), (ii) aan het einde van de probiotische behandeling (na 4 weken), en (iii) ) 4 weken na stopzetting van de inname van probiotica. Van 2,5 ml bloed werd plasma afgescheiden en bewaard bij -70 graden Celsius. Het resterende gehepariniseerde bloed werd gebruikt voor volbloedkweek en voor het meten van frequenties van Th17- en Treg-cellen.

Gehepariniseerd bloed werd gebruikt en anti-CD28 (1 ug/ml) voor stimulatie van T-cellen en lipopolysaccharide voor stimulatie van macrofagen, in afzonderlijke putjes. Kweeksupernatanten werden na 72 uur geoogst en bewaard bij -70°C. Niveaus van cytokinen (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 en IL-4) werden gemeten in kweeksupernatant en plasma met behulp van sandwich-ELISA's.

Th1-, Th2- en Th17-frequenties werden bepaald door stimulatie van volbloed met PMA en ionomycine, gevolgd door kleuring van cellen voor CD4 en intracellulair IFN, IL-4 en IL-1L-17. Voor Treg-opsomming werd dubbele kleuring voor CD4 en Fox-P3 uitgevoerd.

Ethische overwegingen De studie omvat de toediening van probiotica aan gezonde proefpersonen. Deze bevatten echter bacteriën die deel uitmaken van de normale darmflora van gezonde personen en dus vrij zijn van bijwerkingen. Sterker nog, meerdere gezonde personen consumeren deze als 'gezondheidssupplementen'. Daarom mag de toediening van deze middelen niet meer dan een minimaal risico met zich meebrengen. De enige monsters die worden voorgesteld om te worden verzameld, zijn ontlastingsmonsters en kleine hoeveelheden bloed. Er werden geen klinische resultaten verzameld.