Effekt av probiotisk administrering på tarmfloran

Försökspersoner Studien inkluderade 14 friska icke-gravida kvinnor. Alla försökspersoner lämnade ett skriftligt informerat samtycke. Försökspersonerna måste (i) vara fria från systemiska (diabetes, autoimmuna sjukdomar, cancer), gastrointestinala eller leversjukdomar som är kända för att vara förknippade med förändringar i tarmfloran, (ii) vara icke-överviktiga (kroppsmassindex inom området på 20 till 25 kg/m2), och (iii) inte har tagit något antimikrobiellt medel, probiotika, magsyradämpande läkemedel eller läkemedel som förändrar gastrointestinal motilitet, under de senaste 6 veckorna.

Studiedesign Varje försöksperson studerades vid 3 tidpunkter: (i) baslinje (inskrivning), (ii) efter administrering av ett probiotikum i vanlig dos under fyra veckor, och (iii) fyra veckor efter avbrytande av probiotisk administrering. Varje försöksperson fick Cap VSL#3, 2 kapslar dagligen (varje kapsel innehåller 112,5 miljarder bakterier -- en blandning av 8 bakterier -- Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus planta, Lactobacillus planta, Lactobacillus planta. och Lactobacillus delbrueckii). Vid varje tidpunkt studerades tarmens mikrobiotaprofil och immunsvar.

Metagenomisk studie för analys av tarmflora Analys för identifiering och profilering av tarmmikroflora gjordes med användning av sekvensering av V3-regionen av 16S ribosomala ribonukleinsyragenen. Denna gen innehåller nio variabla regioner flankerade av konserverade sträckor i alla bakterier. Amplifiering och sekvensering av vilken hypervariabel region som helst med användning av specifika primrar kan användas för att bestämma naturen av bakterien (fylum, familj, släkte, art, etc). De mest använda regionerna är V3, V4 och V6; vi använde V3-regionen, på grund av dess högre taxonomiska upplösning.

Avföringsprover togs från försökspersoner vid 3 tidpunkter såsom indikeras ovan genom att be patienten att föra avföring in i en ren steril behållare; kärlet frystes omedelbart och transporterades till laboratoriet. DNA isolerades från varje prov med användning av standardprotokoll, kvantifierades, normaliserades och lagrades fryst tills vidare användning.

Polymeraskedjereaktionsamplifiering av V3-regionen gjordes. Gelrenade amplikoner (med olika adaptersekvenser så att data för varje prov kan separeras vid analysstadiet) kvantifierades, normaliserades och slogs samman i ekvimolära kvantiteter (multiplexering). Det multiplexerade biblioteket utsattes för kvalitetskontroll med användning av ett Agilent Bioanalyser DNA-chip.

Sekvenseringsbiblioteket innehållande V3-amplikoner från en ekvi-mängdsblandning av olika kliniska prover sekvenserades med användning av en Illumina-maskin i båda riktningarna. Sekvensavläsningarna lagrades enligt indexsekvenser, underkastades kvalitetskontroll och sekvenser i de två riktningarna smältes samman för att erhålla en enda läsning. Sekvensdata analyserades för att bestämma profilen för tarmfloran.

Immunologiska studier Insamling av blodprover Venöst blod (6 ml) samlades i litiumheparin/EDTA, vid (i) baslinje (innan probiotisk administrering påbörjas), (ii) vid slutet av probiotisk behandling (vid 4 veckor) och (iii) ) 4 veckor efter att probiotikaintaget avbrutits. Från 2,5 ml blod separerades plasma och lagrades vid -70 grader Celsius. Det återstående hepariniserade blodet användes för helblodsodling och för mätning av frekvenser av Th17- och Treg-celler.

Hepariniserat blod användes och anti-CD28 (1 ug/ml) för stimulering av T-celler och lipopolysackarid för stimulering av makrofager, i separata brunnar. Odlingssupernatanter skördades efter 72 timmar och lagrades vid -70 grader Celsius. Nivåer av cytokiner (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 och IL-4) mättes i odlingssupernatant och plasma med användning av sandwich-ELISA.

Th1, Th2 och Th17 frekvenser bestämdes genom stimulering av helblod med PMA och jonomycin, följt av färgning av celler för CD4 och intracellulärt IFN, IL-4 och IL-1L-17. För Treg-uppräkning gjordes dubbelfärgning för CD4 och Fox-P3.

Etiska överväganden Studien omfattar administrering av probiotika till friska försökspersoner. Dessa innehåller dock bakterier som är en del av den normala tarmfloran hos friska personer och därmed fria från några biverkningar. Faktum är att flera friska personer konsumerar dessa som "hälsotillskott". Därför bör administrering av dessa medel inte medföra mer än minimal risk. De enda prover som föreslås att tas är avföringsprover och små volymer blod. Inga kliniska resultat samlades in.