Effekt av probiotisk administrasjon på tarmflorasammensetning

Undersøkelsespersoner Studien inkluderte 14 friske ikke-gravide kvinner. Alle forsøkspersoner ga et skriftlig informert samtykke. Forsøkspersonene måtte (i) være fri for systemiske (diabetes, autoimmun sykdom, kreft), gastrointestinale eller leversykdommer som er kjent for å være assosiert med endringer i tarmfloraen, (ii) være ikke-overvektige (kroppsmasseindeks i området på 20 til 25 kg/m2), og (iii) ikke har tatt noen antimikrobielle midler, probiotika, magesyredempende legemidler eller legemidler som endrer gastrointestinal motilitet, i løpet av de siste 6 ukene.

Studiedesign Hvert individ ble studert ved 3 tidspunkter: (i) baseline (registrering), (ii) etter administrering av et probiotika i vanlig dose i fire uker, og (iii) fire uker etter seponering av probiotisk administrering. Hvert forsøksperson fikk Cap VSL#3, 2 kapsler daglig (hver kapsel inneholder 112,5 milliarder bakterier -- en blanding av 8 bakterier -- Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus planta, Lactobacillus planta, Lactobacillus plant. og Lactobacillus delbrueckii). På hvert tidspunkt ble tarmmikrobiotaprofil og immunrespons studert.

Metagenomisk studie for analyse av tarmflora Analyse for identifikasjon og profilering av tarmmikroflora ble gjort ved bruk av sekvensering av V3-regionen av 16S ribosomale ribonukleinsyregenet. Dette genet inneholder ni variable regioner flankert av konserverte strekninger i alle bakterier. Amplifikasjon og sekvensering av en hvilken som helst hypervariabel region ved bruk av spesifikke primere kan brukes til å bestemme naturen til bakterien (fylum, familie, slekt, art, etc). De mest brukte regionene er V3, V4 og V6; vi brukte V3-regionen på grunn av dens høyere taksonomiske oppløsning.

Avføringsprøver ble tatt fra forsøkspersoner ved 3 tidspunkter som angitt ovenfor ved å be individet føre avføring inn i en ren steril beholder; beholderen ble umiddelbart frosset og fraktet til laboratoriet. DNA ble isolert fra hver prøve ved bruk av standardprotokoller, kvantifisert, normalisert og lagret frosset inntil videre bruk.

Polymerasekjedereaksjonamplifisering av V3-regionen ble utført. Gelrensede amplikoner (med forskjellige adaptersekvenser slik at data for hver prøve kan separeres på analysestadiet) ble kvantifisert, normalisert og samlet i ekvimolare mengder (multipleksing). Det multipleksede biblioteket ble underkastet kvalitetskontroll ved bruk av en Agilent Bioanalyser DNA-brikke.

Sekvenseringsbiblioteket som inneholder V3-amplikoner fra en ekvi-mengde blanding av forskjellige kliniske prøver ble sekvensert ved bruk av en Illumina-maskin i begge retninger. Sekvensavlesningene ble lagret i henhold til indekssekvenser, utsatt for kvalitetskontroll og sekvenser i de to retningene ble smeltet sammen for å oppnå en enkelt lesing. Sekvensdataene ble analysert for å bestemme profilen til tarmfloraen.

Immunologiske studier Innsamling av blodprøver Venøst ​​blod (6 ml) ble samlet i litiumheparin/EDTA, ved (i) baseline (før start av probiotisk administrering), (ii) ved slutten av probiotisk behandling (ved 4 uker), og (iii) ) 4 uker etter seponering av probiotikainntak. Fra 2,5 ml blod ble plasma separert og lagret ved -70 grader celsius. Det gjenværende hepariniserte blodet ble brukt til helblodskultur og for måling av frekvenser av Th17- og Treg-celler.

Heparinisert blod ble brukt og anti-CD28 (1 ug/ml) for stimulering av T-celler og lipopolysakkarid for stimulering av makrofager, i separate brønner. Kultursupernatanter ble høstet etter 72 timer og lagret ved -70 grader celsius. Nivåer av cytokiner (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 og IL-4) ble målt i kultursupernatant og plasma ved bruk av sandwich-ELISA.

Th1, Th2 og Th17 frekvenser ble bestemt ved stimulering av fullblod med PMA og ionomycin, etterfulgt av farging av celler for CD4 og intracellulært IFN, IL-4 og IL-1L-17. For Treg-oppregning ble dobbel farging for CD4 og Fox-P3 utført.

Etiske vurderinger Studien innebærer administrering av probiotika til friske forsøkspersoner. Disse inneholder imidlertid bakterier som er en del av den normale tarmfloraen hos friske personer og dermed fri for uønskede hendelser. Faktisk bruker flere friske personer disse som "helsetilskudd". Derfor bør administrering av disse midlene ikke medføre mer enn minimal risiko. De eneste prøvene som foreslås tatt er avføringsprøver og små volumer blod. Ingen kliniske utfall ble samlet inn.