Wirkung der probiotischen Verabreichung auf die Zusammensetzung der Darmflora

Studienteilnehmer An der Studie nahmen 14 gesunde, nicht schwangere Frauen teil. Alle Probanden gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab. Die Probanden mussten (i) frei von systemischen (Diabetes, Autoimmunerkrankungen, Krebs), Magen-Darm- oder Lebererkrankungen sein, von denen bekannt ist, dass sie mit Veränderungen der Darmflora verbunden sind, (ii) nicht fettleibig sein (Body-Mass-Index im Bereich von 20 bis 25 kg/m2) und (iii) in den letzten 6 Wochen keine antimikrobiellen Mittel, Probiotika, magensäurehemmenden Medikamente oder Medikamente eingenommen haben, die die Magen-Darm-Motilität verändern.

Studiendesign Jeder Proband wurde zu 3 Zeitpunkten untersucht: (i) Baseline (Einschreibung), (ii) nach vierwöchiger Verabreichung eines Probiotikums in üblicher Dosis und (iii) vier Wochen nach Absetzen der probiotischen Verabreichung. Jeder Proband erhielt Cap VSL#3, 2 Kapseln täglich (jede Kapsel enthält 112,5 Milliarden Bakterien – eine Mischung aus 8 Bakterien – Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, und Lactobacillus delbrueckii). Zu jedem Zeitpunkt wurden das Profil der Darmmikrobiota und die Immunantworten untersucht.

Metagenomische Studie zur Analyse der Darmflora Die Analyse zur Identifizierung und Profilerstellung der Darmmikroflora wurde unter Verwendung der Sequenzierung der V3-Region des 16S-ribosomalen Ribonukleinsäuregens durchgeführt. Dieses Gen enthält neun variable Regionen, die in allen Bakterien von konservierten Abschnitten flankiert werden. Die Amplifikation und Sequenzierung jeder hypervariablen Region unter Verwendung spezifischer Primer kann verwendet werden, um die Natur des Bakteriums (Stamm, Familie, Gattung, Art usw.) zu bestimmen. Die am häufigsten verwendeten Regionen sind V3, V4 und V6; Wir haben die V3-Region aufgrund ihrer höheren taxonomischen Auflösung verwendet.

Stuhlproben wurden von Subjekten zu 3 Zeitpunkten wie oben angegeben gesammelt, indem die Subjekte gebeten wurden, Stuhl in einen sauberen sterilen Behälter zu passieren; das Gefäß wurde sofort eingefroren und ins Labor transportiert. Die DNA wurde aus jeder Probe unter Verwendung von Standardprotokollen isoliert, quantifiziert, normalisiert und bis zur weiteren Verwendung eingefroren gelagert.

Es wurde eine Amplifikation der V3-Region durch Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. Gelgereinigte Amplikons (mit unterschiedlichen Adaptersequenzen, damit die Daten für jede Probe in der Analysephase getrennt werden können) wurden quantifiziert, normalisiert und in äquimolaren Mengen gepoolt (Multiplexing). Die gemultiplexte Bibliothek wurde einer Qualitätskontrolle unter Verwendung eines Agilent Bioanalyzer DNA Chips unterzogen.

Die Sequenzierungsbibliothek, die V3-Amplikons aus einer Mischung verschiedener klinischer Proben in gleichen Mengen enthielt, wurde unter Verwendung einer Illumina-Maschine in beiden Richtungen sequenziert. Die Sequenz-Reads wurden gemäß Indexsequenzen gebinnt, einer Qualitätskontrolle unterzogen und Sequenzen in den beiden Richtungen wurden miteinander fusioniert, um einen einzigen Read zu erhalten. Die Sequenzdaten wurden analysiert, um das Profil der Darmflora zu bestimmen.

Immunologische Studien Entnahme von Blutproben Venöses Blut (6 ml) wurde in Lithiumheparin/EDTA zu (i) Baseline (vor Beginn der probiotischen Verabreichung), (ii) am Ende der probiotischen Behandlung (nach 4 Wochen) und (iii ) 4 Wochen nach Beendigung der probiotischen Einnahme. Aus 2,5 ml Blut wurde Plasma abgetrennt und bei -70 Grad Celsius gelagert. Das verbleibende heparinisierte Blut wurde für eine Vollblutkultur und zur Messung der Frequenzen von Th17- und Treg-Zellen verwendet.

Heparinisiertes Blut wurde verwendet und Anti-CD28 (1 ug/ml) zur Stimulierung von T-Zellen und Lipopolysaccharid zur Stimulierung von Makrophagen in getrennten Vertiefungen. Kulturüberstände wurden nach 72 Stunden geerntet und bei –70 Grad Celsius gelagert. Die Konzentrationen von Zytokinen (TNF-alpha, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 und IL-4) wurden im Kulturüberstand und im Plasma unter Verwendung von Sandwich-ELISAs gemessen.

Th1-, Th2- und Th17-Frequenzen wurden durch Stimulierung von Vollblut mit PMA und Ionomycin bestimmt, gefolgt von Färbung der Zellen auf CD4 und intrazelluläres IFN, IL-4 und IL-1L-17. Für die Treg-Zählung wurde eine Doppelfärbung für CD4 und Fox-P3 durchgeführt.

Ethische Erwägungen Die Studie beinhaltet die Verabreichung von Probiotika an gesunde Probanden. Diese enthalten jedoch Bakterien, die bei Gesunden zur normalen Darmflora gehören und somit frei von Nebenwirkungen sind. Tatsächlich konsumieren mehrere gesunde Personen diese als „Gesundheitsergänzungen“. Daher sollte die Verabreichung dieser Mittel nicht mehr als ein minimales Risiko mit sich bringen. Die einzigen Proben, die zur Entnahme vorgeschlagen werden, sind Stuhlproben und kleine Blutmengen. Es wurden keine klinischen Ergebnisse erhoben.