Wpływ podawania probiotyku na skład flory jelitowej

Osoby badane Badaniem objęto 14 zdrowych kobiet niebędących w ciąży. Wszyscy badani wyrazili pisemną świadomą zgodę. Pacjenci musieli (i) być wolni od chorób ogólnoustrojowych (cukrzyca, choroby autoimmunologiczne, nowotwory), chorób przewodu pokarmowego lub wątroby, o których wiadomo, że są związane ze zmianami flory jelitowej, (ii) nie być otyłymi (wskaźnik masy ciała w zakresie od 20 do 25 kg/m2) oraz (iii) nie przyjmował żadnych środków przeciwdrobnoustrojowych, probiotyków, leków zmniejszających wydzielanie kwasu żołądkowego ani leków zmieniających motorykę przewodu pokarmowego w ciągu ostatnich 6 tygodni.

Projekt badania Każdego osobnika badano w 3 punktach czasowych: (i) linia wyjściowa (włączenie), (ii) po podaniu probiotyku w zwykłej dawce przez cztery tygodnie i (iii) cztery tygodnie po przerwaniu podawania probiotyku. Każdy pacjent otrzymywał Cap VSL#3, 2 kapsułki dziennie (każda kapsułka zawiera 112,5 miliarda bakterii – mieszaninę 8 bakterii – Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, i Lactobacillus delbrueckii). W każdym punkcie czasowym badano profil mikroflory jelitowej i odpowiedzi immunologiczne.

Badanie metagenomiczne w celu analizy flory jelitowej Analizę w celu identyfikacji i profilowania mikroflory jelitowej przeprowadzono przy użyciu sekwencjonowania regionu V3 genu 16S rybosomalnego kwasu rybonukleinowego. Gen ten zawiera dziewięć regionów zmiennych otoczonych konserwatywnymi odcinkami we wszystkich bakteriach. Amplifikację i sekwencjonowanie dowolnego regionu hiperzmiennego przy użyciu specyficznych starterów można wykorzystać do określenia natury bakterii (rodzaj, rodzina, rodzaj, gatunek itp.). Najczęściej używane regiony to V3, V4 i V6; wykorzystaliśmy region V3 ze względu na jego wyższą rozdzielczość taksonomiczną.

Próbki kału pobierano od osobników w 3 punktach czasowych, jak wskazano powyżej, prosząc osobnika o oddanie stolca do czystego sterylnego pojemnika; pojemnik natychmiast zamrożono i przetransportowano do laboratorium. DNA wyizolowano z każdej próbki przy użyciu standardowych protokołów, oznaczono ilościowo, znormalizowano i przechowywano w stanie zamrożonym do dalszego użycia.

Przeprowadzono amplifikację regionu V3 w reakcji łańcuchowej polimerazy. Oczyszczone w żelu amplikony (z różnymi sekwencjami adapterów, tak aby dane dla każdej próbki można było rozdzielić na etapie analizy) oznaczono ilościowo, znormalizowano i połączono w ilości równomolowe (multipleksowanie). Zmultipleksowaną bibliotekę poddano kontroli jakości przy użyciu Agilent Bioanalyser DNA Chip.

Bibliotekę do sekwencjonowania zawierającą amplikony V3 z mieszaniny równych ilości różnych próbek klinicznych sekwencjonowano przy użyciu maszyny Illumina w obu kierunkach. Odczyty sekwencji zostały podzielone zgodnie z sekwencjami indeksu, poddane kontroli jakości, a sekwencje w dwóch kierunkach zostały połączone razem, aby uzyskać pojedynczy odczyt. Dane sekwencji analizowano w celu określenia profilu flory jelitowej.

Badania immunologiczne Pobieranie próbek krwi Krew żylną (6 ml) pobrano w mieszaninie heparyna litowa/EDTA w (i) punkcie wyjściowym (przed rozpoczęciem podawania probiotyku), (ii) pod koniec leczenia probiotykami (w 4 tygodniu) oraz (iii ) po 4 tygodniach od odstawienia probiotyku. Z 2,5 ml krwi oddzielono osocze i przechowywano w -70 stopniach Celsjusza. Pozostałą heparynizowaną krew wykorzystano do posiewu krwi pełnej oraz do pomiaru częstości komórek Th17 i Treg.

Zastosowano heparynizowaną krew i anty-CD28 (1 μg/ml) do stymulacji komórek T i lipopolisacharyd do stymulacji makrofagów w oddzielnych dołkach. Supernatanty hodowli zebrano po 72 godzinach i przechowywano w -70 stopniach Celsjusza. Poziomy cytokin (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 i IL-4) mierzono w supernatancie hodowli i osoczu przy użyciu kanapkowych testów ELISA.

Częstości Th1, Th2 i Th17 określono przez stymulację krwi pełnej PMA i jonomycyną, a następnie barwienie komórek na obecność CD4 i wewnątrzkomórkowego IFN, IL-4 i IL-1L-17. W celu wyliczenia Treg przeprowadzono podwójne barwienie dla CD4 i Fox-P3.

Względy etyczne Badanie polega na podawaniu probiotyków osobom zdrowym. Zawierają one jednak bakterie, które są częścią normalnej flory jelitowej u zdrowych osób, a zatem są wolne od jakichkolwiek działań niepożądanych. W rzeczywistości kilka zdrowych osób spożywa je jako „suplementy zdrowotne”. Dlatego podawanie tych środków nie powinno wiązać się z większym ryzykiem niż minimalne. Jedynymi próbkami, które proponuje się pobrać, są próbki kału i małe objętości krwi. Nie zebrano żadnych wyników klinicznych.