Efeito da administração de probióticos na composição da flora intestinal

Sujeitos do estudo O estudo incluiu 14 mulheres não grávidas saudáveis. Todos os indivíduos forneceram um consentimento informado por escrito. Os participantes deveriam (i) estar livres de doenças sistêmicas (diabetes, doença autoimune, câncer), gastrointestinais ou hepáticas sabidamente associadas a alterações na flora intestinal, (ii) não ser obesos (índice de massa corporal na faixa de 20 a 25 Kg/m2), e (iii) não ter tomado nenhum antimicrobiano, probióticos, drogas supressoras de ácido gástrico ou drogas que alteram a motilidade gastrointestinal, nas 6 semanas anteriores.

Desenho do estudo Cada indivíduo foi estudado em 3 momentos: (i) linha de base (inscrição), (ii) após a administração de um probiótico na dose usual por quatro semanas e (iii) quatro semanas após a descontinuação da administração do probiótico. Cada indivíduo recebeu Cap VSL#3, 2 cápsulas diariamente (cada cápsula contém 112,5 bilhões de bactérias -- uma mistura de 8 bactérias -- Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, e Lactobacillus delbrueckii). Em cada ponto de tempo, o perfil da microbiota intestinal e as respostas imunes foram estudados.

Estudo metagenómico para análise da flora intestinal A análise para identificação e caracterização da microflora intestinal foi realizada através da sequenciação da região V3 do gene do ácido ribonucléico ribossomal 16S. Esse gene contém nove regiões variáveis ​​flanqueadas por trechos conservados em todas as bactérias. A amplificação e o sequenciamento de qualquer região hipervariável usando primers específicos podem ser usados ​​para determinar a natureza da bactéria (filo, família, gênero, espécie, etc). As regiões mais utilizadas são V3, V4 e V6; usamos a região V3, devido a sua maior resolução taxonômica.

As amostras de fezes foram coletadas dos indivíduos em 3 pontos de tempo, conforme indicado acima, pedindo ao indivíduo para passar as fezes em um receptáculo estéril limpo; o receptáculo foi imediatamente congelado e transportado para o laboratório. O DNA foi isolado de cada espécime usando protocolos padrão, quantificado, normalizado e armazenado congelado até uso posterior.

A amplificação da reação em cadeia da polimerase da região V3 foi feita. Os amplicons purificados em gel (com diferentes sequências adaptadoras para que os dados de cada amostra possam ser separados na etapa de análise) foram quantificados, normalizados e agrupados em quantidades equimolares (multiplexação). A biblioteca multiplexada foi submetida a controle de qualidade usando um chip de DNA Agilent Bioanalyser.

A biblioteca de sequenciamento contendo amplicons V3 de uma mistura de quantidade equivalente de várias amostras clínicas foi sequenciada usando uma máquina Illumina em ambas as direções. As leituras de sequência foram agrupadas de acordo com as sequências de índice, submetidas a controle de qualidade e as sequências nas duas direções foram fundidas para obter uma única leitura. Os dados da sequência foram analisados ​​para determinar o perfil da flora intestinal.

Estudos imunológicos Coleta de amostras de sangue Sangue venoso (6 ml) foi coletado em heparina de lítio/EDTA, em (i) linha de base (antes de iniciar a administração de probióticos), (ii) no final do tratamento com probióticos (em 4 semanas) e (iii ) em 4 semanas após a interrupção da ingestão de probióticos. De 2,5 ml de sangue, o plasma foi separado e armazenado a -70 graus centígrados. O sangue heparinizado restante foi utilizado para cultura de sangue total e para medição das frequências de células Th17 e Treg.

Foi utilizado sangue heparinizado e anti-CD28 (1 ug/ml) para estimulação de células T e lipopolissacarídeo para estimulação de macrófagos, em poços separados. Os sobrenadantes da cultura foram colhidos após 72 horas e armazenados a -70 graus centígrados. Os níveis de citocinas (TNF-alfa, IL-10, IFN-gama, IL-12p70, IL-6 e IL-4) foram medidos no sobrenadante da cultura e no plasma usando ELISAs sanduíche.

As frequências de Th1, Th2 e Th17 foram determinadas por estimulação de sangue total com PMA e ionomicina, seguida de coloração de células para CD4 e IFN intracelular, IL-4 e IL-1L-17. Para a enumeração de Treg, foi feita coloração dupla para CD4 e Fox-P3.

Considerações éticas O estudo envolve a administração de probióticos a indivíduos saudáveis. No entanto, estes contêm bactérias que fazem parte da flora intestinal normal em pessoas saudáveis ​​e, portanto, livres de quaisquer eventos adversos. De fato, várias pessoas saudáveis ​​os consomem como 'suplementos de saúde'. Portanto, a administração desses agentes não deve acarretar mais do que um risco mínimo. As únicas amostras propostas para serem coletadas são amostras de fezes e pequenos volumes de sangue. Nenhum desfecho clínico foi coletado.