Effekt af probiotisk administration på tarmfloraens sammensætning

Undersøgelsespersoner Undersøgelsen omfattede 14 raske ikke-gravide kvinder. Alle forsøgspersoner gav et skriftligt informeret samtykke. Forsøgspersonerne skulle (i) være fri for systemiske (diabetes, autoimmune sygdomme, cancer), gastrointestinale eller leversygdomme, der vides at være forbundet med ændringer i tarmfloraen, (ii) være ikke-overvægtige (body mass index i området på 20 til 25 kg/m2), og (iii) ikke har taget noget antimikrobielt middel, probiotika, mavesyredæmpende lægemidler eller lægemidler, der ændrer gastrointestinal motilitet, i de foregående 6 uger.

Undersøgelsesdesign Hvert individ blev undersøgt på 3 tidspunkter: (i) baseline (tilmelding), (ii) efter administration af et probiotikum i sædvanlig dosis i fire uger og (iii) fire uger efter seponering af probiotisk administration. Hvert forsøgsperson modtog Cap VSL#3, 2 kapsler dagligt (hver kapsel indeholder 112,5 milliarder bakterier - en blanding af 8 bakterier - Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus planta, Lactobacillus planta, paracillus planta. og Lactobacillus delbrueckii). På hvert tidspunkt blev tarmens mikrobiotaprofil og immunrespons undersøgt.

Metagenomisk undersøgelse til analyse af tarmflora Analyse til identifikation og profilering af tarmmikroflora blev udført ved hjælp af sekventering af V3-regionen af ​​16S ribosomale ribonukleinsyregenet. Dette gen indeholder ni variable regioner flankeret af konserverede strækninger i alle bakterier. Amplifikation og sekventering af enhver hypervariabel region under anvendelse af specifikke primere kan anvendes til at bestemme bakteriens natur (fylum, familie, slægt, art osv.). De mest udbredte regioner er V3, V4 og V6; vi brugte V3-regionen på grund af dens højere taksonomiske opløsning.

Afføringsprøver blev opsamlet fra forsøgspersoner på 3 tidspunkter som angivet ovenfor ved at bede individet om at føre afføring ind i en ren steril beholder; beholderen blev straks frosset og transporteret til laboratoriet. DNA blev isoleret fra hver prøve under anvendelse af standardprotokoller, kvantificeret, normaliseret og opbevaret frosset indtil videre brug.

Polymerasekædereaktionsamplifikation af V3-regionen blev udført. Geloprensede amplikoner (med forskellige adaptersekvenser, så data for hver prøve kan adskilles på analysestadiet) blev kvantificeret, normaliseret og samlet i ækvimolære mængder (multipleksing). Det multipleksede bibliotek blev underkastet kvalitetskontrol ved anvendelse af en Agilent Bioanalyser DNA-chip.

Sekvenseringsbiblioteket indeholdende V3-amplikoner fra en ækvi-mængde blanding af forskellige kliniske prøver blev sekventeret ved anvendelse af en Illumina-maskine i begge retninger. Sekvensaflæsningerne blev lagret i henhold til indekssekvenser, underkastet kvalitetskontrol, og sekvenser i de to retninger blev smeltet sammen for at opnå en enkelt aflæsning. Sekvensdataene blev analyseret for at bestemme profilen af ​​tarmfloraen.

Immunologiske undersøgelser Indsamling af blodprøver Venøst ​​blod (6 ml) blev opsamlet i lithiumheparin/EDTA, ved (i) baseline (før start af probiotisk administration), (ii) ved slutningen af ​​probiotisk behandling (ved 4 uger) og (iii) ) 4 uger efter seponering af probiotikaindtagelse. Fra 2,5 ml blod blev plasma separeret og opbevaret ved -70 grader celsius. Det resterende hepariniserede blod blev brugt til helblodskultur og til måling af frekvenser af Th17- og Treg-celler.

Hepariniseret blod blev anvendt og anti-CD28 (1 ug/ml) til stimulering af T-celler og lipopolysaccharid til stimulering af makrofager i separate brønde. Kultursupernatanter blev høstet efter 72 timer og opbevaret ved -70 grader Celsius. Niveauer af cytokiner (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 og IL-4) blev målt i kultursupernatant og plasma under anvendelse af sandwich-ELISA'er.

Th1-, Th2- og Th17-frekvenser blev bestemt ved stimulering af fuldblod med PMA og ionomycin efterfulgt af farvning af celler for CD4 og intracellulært IFN, IL-4 og IL-1L-17. Til Treg-optælling blev dobbeltfarvning for CD4 og Fox-P3 udført.

Etiske overvejelser Studiet involverer administration af probiotika til raske forsøgspersoner. Disse indeholder dog bakterier, der er en del af den normale tarmflora hos raske personer og dermed fri for uønskede hændelser. Faktisk indtager flere raske personer disse som 'sundhedstilskud'. Derfor bør administrationen af ​​disse midler ikke medføre mere end minimal risiko. De eneste prøver, der foreslås indsamlet, er afføringsprøver og små mængder blod. Ingen kliniske resultater blev indsamlet.