A probiotikus adagolás hatása a bélflóra összetételére

A vizsgálat alanyai A vizsgálatban 14 egészséges, nem terhes nő vett részt. Minden alany írásos beleegyezését adta. Az alanyoknak (i) mentesnek kellett lenniük olyan szisztémás (cukorbetegség, autoimmun betegségek, rák), gyomor-bélrendszeri vagy májbetegségektől, amelyekről ismert, hogy a bélflóra megváltozásával járnak, (ii) nem elhízottaknak (testtömegindex a tartományban van). 20-25 kg/m2), és (iii) nem szedett semmilyen antimikrobiális szert, probiotikumot, gyomorsav-szuppresszáns gyógyszert vagy olyan gyógyszert, amely megváltoztatja a gyomor-bélrendszer motilitását az elmúlt 6 hétben.

A vizsgálat felépítése Mindegyik alanyt 3 időpontban vizsgáltuk: (i) kiindulási állapot (beiratkozás), (ii) probiotikum szokásos dózisának beadása után négy hétig, és (iii) négy héttel a probiotikum adásának abbahagyása után. Minden alany kapott Cap VSL#3, napi 2 kapszulát (minden kapszula 112,5 milliárd baktériumot tartalmaz -- 8 baktérium keveréke -- Streptococcus thermophilus, Bifido-bacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, paracastobacillus és Lactobacillus delbrueckii). Minden időpontban tanulmányozták a bél mikrobiota profilját és az immunválaszokat.

Metagenómiai vizsgálat a bélflóra elemzésére A bél mikroflóra azonosítására és profilálására szolgáló elemzést a 16S riboszomális ribonukleinsav gén V3 régiójának szekvenálásával végeztük. Ez a gén kilenc variábilis régiót tartalmaz, amelyeket minden baktériumban konzervált szakaszok szegélyeznek. Bármely hipervariábilis régió amplifikációja és szekvenálása specifikus primerek segítségével felhasználható a baktérium természetének (törzscsoport, család, nemzetség, faj stb.) meghatározására. A legszélesebb körben használt régiók a V3, V4 és V6; V3 régiót használtunk, a nagyobb taxonómiai felbontás miatt.

Az alanyoktól székletmintát vettünk 3 időpontban, a fent jelzett módon, megkérve az alanyt, hogy engedje át a székletet egy tiszta, steril edénybe; a tartályt azonnal lefagyasztották és a laboratóriumba szállították. A DNS-t minden mintából standard protokollok alkalmazásával izoláltuk, mennyiségileg meghatároztuk, normalizáltuk és fagyasztva tároltuk a további felhasználásig.

A V3 régió polimeráz láncreakciós amplifikációját végeztük. A géllel tisztított amplikonokat (különböző adapterszekvenciákkal, hogy az egyes minták adatait el lehessen választani az elemzési szakaszban) számszerűsítettük, normalizáltuk és ekvimoláris mennyiségben egyesítettük (multiplexelés). A multiplexelt könyvtárat minőségellenőrzésnek vetettük alá Agilent Bioanalyser DNS Chip használatával.

A különböző klinikai minták azonos mennyiségű keverékéből származó V3 amplikonokat tartalmazó szekvenáló könyvtárat Illumina gép segítségével mindkét irányban szekvenáltuk. A leolvasott szekvenciákat indexszekvenciák szerint összegyűjtöttük, minőség-ellenőrzésnek vetették alá, és a két irányú szekvenciákat egyesítettük, hogy egyetlen leolvasást kapjunk. A szekvencia adatokat elemeztük a bélflóra profiljának meghatározására.

Immunológiai vizsgálatok Vérminták vétele Vénás vért (6 ml) lítium-heparin/EDTA oldatban gyűjtöttünk (i) a kiinduláskor (a probiotikus beadás megkezdése előtt), (ii) a probiotikus kezelés végén (4 héttel) és (iii) ) 4 héttel a probiotikumok szedésének abbahagyása után. 2,5 ml vérből plazmát választottunk el, és -70 °C-on tároltuk. A fennmaradó heparinizált vért teljes vértenyésztésre, valamint a Th17 és Treg sejtek gyakoriságának mérésére használták fel.

Heparinizált vért és anti-CD28-at (1 ug/ml) használtunk a T-sejtek stimulálására és lipopoliszacharidot a makrofágok stimulálására, külön üregekben. A tenyészet felülúszóit 72 óra elteltével gyűjtöttük össze, és -70 °C-on tároltuk. A citokinek (TNF-alfa, IL-10, IFN-gamma, IL-12p70, IL-6 és IL-4) szintjét a tenyészet felülúszójában és a plazmában mértük szendvics ELISA-val.

A Th1, Th2 és Th17 gyakoriságát a teljes vér PMA-val és ionomicinnel történő stimulálásával határoztuk meg, majd a sejteket CD4-re és intracelluláris IFN-re, IL-4-re és IL-1L-17-re festették. A Treg-számláláshoz kettős festést végeztünk a CD4 és a Fox-P3 esetében.

Etikai megfontolások A vizsgálat egészséges alanyoknak probiotikumok beadását foglalja magában. Ezek azonban olyan baktériumokat tartalmaznak, amelyek az egészséges emberek normál bélflórájának részét képezik, és így mentesek minden káros eseménytől. Valójában számos egészséges ember fogyasztja ezeket „egészségkiegészítőként”. Ezért ezeknek a szereknek a beadása nem járhat több kockázattal a minimálisnál. Az egyetlen gyűjtésre javasolt minta székletminták és kis mennyiségű vér. Nem gyűjtöttek klinikai eredményeket.