益生菌给药对肠道菌群组成的影响

研究对象 该研究包括 14 名健康的未怀孕女性。 所有受试者都提供了书面知情同意书。 受试者必须 (i) 没有全身性（糖尿病、自身免疫性疾病、癌症）、胃肠道或肝脏疾病，这些疾病已知与肠道菌群的改变有关，(ii) 不肥胖（体重指数在20 至 25 公斤/平方米），以及 (iii) 在过去 6 周内未服用任何抗微生物剂、益生菌、胃酸抑制剂或改变胃肠动力的药物。

研究设计 每个受试者在 3 个时间点进行研究：(i) 基线（登记），(ii) 以常规剂量施用益生菌 4 周后，以及 (iii) 停止益生菌施用后 4 周。 每个受试者接受 Cap VSL#3，每天 2 粒胶囊（每粒胶囊含有 1125 亿细菌——8 种细菌的混合物——嗜热链球菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、和德氏乳杆菌）。 在每个时间点，研究肠道微生物群概况和免疫反应。

用于分析肠道菌群的宏基因组学分析 用于鉴定和分析肠道菌群的分析是通过对 16S 核糖体核糖核酸基因的 V3 区进行测序来完成的。 该基因包含九个可变区域，两侧是所有细菌中的保守延伸。 使用特异性引物对任何高变区进行扩增和测序可用于确定细菌的性质（门、科、属、种等）。 使用最广泛的区域是V3、V4和V6；我们使用 V3 区域，因为它具有更高的分类分辨率。

如上所述，通过要求受试者将粪便排入干净的无菌容器中，在 3 个时间点从受试者收集粪便标本；容器立即被冷冻并运送到实验室。 使用标准方案从每个标本中分离 DNA、量化、归一化并冷冻储存直至进一步使用。

进行了 V3 区的聚合酶链反应扩增。 凝胶纯化的扩增子（具有不同的接头序列，以便每个样品的数据可以在分析阶段分离）被量化、归一化并以等摩尔量（多路复用）汇集。 使用安捷伦生物分析仪 DNA 芯片对多重文库进行质量控制。

使用 Illumina 机器在两个方向上对包含来自各种临床样本的等量混合物的 V3 扩增子的测序文库进行测序。 序列读数根据索引序列分箱，进行质量控制，并将两个方向的序列融合在一起以获得单个读数。 分析序列数据以确定肠道菌群的概况。

免疫学研究 血液标本的收集 在 (i) 基线（开始益生菌给药前），(ii) 益生菌治疗结束时（4 周时），和 (iii) 在肝素锂/EDTA 中收集静脉血 (6 ml) ) 在停止摄入益生菌后 4 周。 从 2.5 毫升血液中分离出血浆并储存在 -70 摄氏度。 剩余的肝素化血液用于全血培养和 Th17 和 Treg 细胞频率的测量。

在单独的孔中，使用肝素化血液和抗 CD28 (1 ug/ml) 来刺激 T 细胞和脂多糖来刺激巨噬细胞。 72小时后收获培养物上清液并储存在-70摄氏度。 使用夹心 ELISA 测量培养物上清液和血浆中细胞因子（TNF-α、IL-10、IFN-γ、IL-12p70、IL-6 和 IL-4）的水平。

Th1、Th2 和 Th17 频率通过用 PMA 和离子霉素刺激全血，然后对细胞进行 CD4 和细胞内 IFN、IL-4 和 IL-1L-17 染色来确定。 对于 Treg 计数，对 CD4 和 Fox-P3 进行了双重染色。

伦理学考虑 该研究涉及对健康受试者施用益生菌。 然而，这些含有的细菌是健康人正常肠道菌群的一部分，因此没有任何不良事件。 事实上，一些健康的人将这些作为“保健品”食用。 因此，这些药物的使用不应带来超过最低限度的风险。 建议收集的唯一标本是粪便标本和少量血液。 没有收集临床结果。